Transfectie, welke mogelijkheden zijn er?

Transfectie is het proces van het overbrengen van één bepaalde nucleine sequentie in een eukaryote cel. Nucleine sequenties die vaak gebruikt worden zijn DNA, RNA en eiwitten. Welke methodes zijn verkrijgbaar voor de transfectie? Hier worden er een aantal beschreven.

Magnetofectie
Magnetofectie is één van de mogelijkheden. Deze methode bindt nucleïnezuren of andere vectoren met magnetische nanodeeltjes, welke bedekt zijn met kationische moleculen. De magnetische nanodeeltjes zijn gemaakt van ijzer oxide, wat volledig biologisch afbreekbaar is, gecoat met specifieke kationische gepatenteerde moleculen. Hun associatie met het gen (DNA, siRNA, ODN, virus, etc.) wordt bereikt door zout-geïnduceerde colloïdaal aggregatie en elektrostatische interactie van de vectoren.

De resulterende moleculaire complexen zijn vervolgens gericht op de cellen, ondersteund door een passende magnetisch veld. Membraan architectuur en structuur blijven intact in tegenstelling tot andere fysieke transfectie methoden die schade geven of electroshock, die een gat maken in de celmembranen. Bovendien zijn de magnetische nanobeads volledig biologisch afbreekbaar en niet giftig bij de aanbevolen doseringen en zelfs nog hoger. Op deze manier wordt de volledige toegepast vector geconcentreerd op de cellen. Dus 100% van de cellen komt in contact met een belangrijke vector dosis.

Lipofectie

Lipofectie is een methode om genetische materiaal in de cel te brengen gebruik makende van liposomen. Het lipofectamine vormt vesikels met de complexen waarvan de buitenzijde qua samenstelling gelijkaardig is met die van het celmembraan. Als gevolg hiervan zullen de vesikels samensmelten met het celmembraan en zijn inhoud in de cel loodsen.

 

Elektroporatie

Elektroporatie is een techniek die door het aanleggen van een extern elektrische veld een verhoging van de elektrische geleiding en de permeabiliteit van het celmembraan als gevolg heeft. Het is een methode om extracellulaire partikels in de cel te brengen. De elektroporatiecondities moeten zodanig gekozen worden dat na introductie van de extracellulaire partikels het celmembraan zich spontaan herstelt en dat de schade aan de cellen zoveel mogelijk beperkt blijft.

 

i-MICST

De i-MICST (Intergrated Magnetic Immuno-Cell Sorting and Transfection/Transduction) technologie biedt de mogelijkheid om cellen te isoleren en modificeren in één efficiënte en betrouwbaar systeem.

Cytokeratines, dé tool in cytopathologie en cytometrische testen.

Cytokeratines

Cytokeratines (CK) zijn keratine bevattende eiwitten in de intermediaire filamenten welke gevonden worden in het intracytoplasmatisch cytoskelet van epitheel cellen.
De term cytokeratines wordt gebruikt sinds de jaren ’70, toen de subunits van de keratine ontdekt werden in de cellen. In 2006 is een nieuwe systematische naamgeving (CK1 t/m CK20) vanwege de biochemische diversiteit van de verschillende keratines. CK1 heeft het hoogste molecuulgewicht en hoogste isoelectrisch punt, terwijl CK19 het laagste molecuulgewicht en isoelectrisch punt heeft. Ze zijn opgedeeld in type I en type II sub klasse. De type I zijn de cytokeratines, genummerd CK9 t/m CK20, met een lage pH. De type II, genummerd CK1 t/m CK8, zijn basisch to pH neutraal.

Deze slideshow heeft JavaScript nodig.

Celbiologie

In het cytoplasma, vormen de keratine filamenten een complex netwerk welke reikt van de celkern tot aan het celmembraan. Verschillende complementaire eiwitten spelen een rol in het ontstaan en de handhaving van dit complex. 
Deze verbinding tussen het celmembraan en de celkern levert belangrijke informatie over het cytoplasma en de cellulaire communicatie. Uit verschillende studies is gebleken dat de keratines een rol spelen in de celmitose, de differentiatie en het voortbewegen van de cel.
De intermediaire filamenten van de eukaryotische cytoskelet, van welke cytokeratines één van de drie bestandsdelen is, zijn geassocieerd met het ankyrine en spectrine complex welke zich net onder het celmembraan bevindt.

 Diagnostiek

Intermediaire filamenten komen voor in vrijwel iedere cel van het menselijk lichaam en zijn een wezenlijk onderdeel van het cytoskelet. De filamenten zijn specifiek voor een weefsel, waardoor ze met behulp van antilichaam gericht tegen het intermediaire filamenteiwit epithiale, mesenchymale, spier-, zenuw- en gliacellen van elkaar kunnen onderscheiden. Dit geldt niet alleen voor gezond weefsel maar ook voor kwaadaardig weefsel en metastasen daarvan.
Antilichamen gericht tegen intermediaire filamenten kunnen belangrijke bijdrage leveren aan de differentiële diagnostiek van tumoren bij de mensen doordat met immunohistochemie op vriescoupes van operatiepreparaten en in uitstrijkpreparaten van sputum, urine of met de dunne naald geaspireerd weefsel de intermediaire filamenten zichtbaar gemaakt kunnen worden.

Het Ph chromosoom, het genetisch defect bij chronische myeloide leukemie (CML)

Chronisch myeloide leukemie (CML) is een vorm van leukemie waarbij witte bloedcellen in overmaat worden geproduceerd. Bij de grote meerderheid wordt het Philadelphia chromosoom gevonden. Het Ph chromosoom is verantwoordelijk voor de codering van BCR-ABL1.

Na de ontdekking van CML, meer dan 150 jaar geleden is er weinig tot geen progressie gemaakt met betrekking tot de genezing. Bestraling zorgde alleen voor een betere levenskwaliteit. De genezingskansen werden groter met de behandeling met Hydroxyurea (HU), en daarna nog groter met allogene hematopoietische stamcel transplantatie.

Het begrijpen van de ziekte begon met de ontdekking van het Philadelphia (Ph) chromosoom. De aanwezigheid van de Ph chromosoom is het gevolg van een genetische translocatie van de chromosomen 9 en 22. De ontdekking van het Ph chromosoom betekende ook de ontdekking van de BCR/ABL1 eiwitten, wat heeft geleid tot nieuwe onderzoeken. Door componenten te ontwikkelen die de activiteit van de tyrokinase verminderen, en dus de ontwikkeling van de ziekte remmen, is er een grote stap gezet in de ontwikkeling van een medicijn.

Detectie methode
Recent is er een nieuwe methode op de markt gekomen om dit Ph chromosoom te detecteren. Bij deze methode wordt een qPCR gecombineerd met een ELISA waarbij gebruik gemaakt wordt van beads. Dit biedt mogelijkheid om meerdere samples tegelijkertijd te testen met een hoge gevoeligheid, de detectie limiet ligt op 1 leukemie cel per 100.000 normale cellen . Door het monitoren van de tyrosine kinase inhibitor (TKI) ontstaat er een goede indicatie over de progressie van de ziekte.

Beschikbare methodes voor eiwitexpressie

Eiwitten spelen een belangrijke rol in veel verschillende biologische processen. Om een eiwit te bestuderen is er vaak een grote hoeveelheid van het eiwit nodig. Wat zijn de mogelijkheden om een grote hoeveelheid eiwit te verkrijgen? Is er verschil in opbrengst en kwaliteit van het eiwit na het tot expressie brengen door een methode? En in hoeverre zijn post-translationele modificaties belangrijk voor de oplosbaarheid van het eiwit? Hier wordt beschreven wat de mogelijkheden zijn en hun voor- en nadelen.

Eiwitexpressie in bacteriën
Eiwitexpressie in bacteriën is de meest bekende, gemakkelijkste en meest gebruikte vorm van eiwitexpressie. Eiwitexpressie in een microbiële eukaryotische gastheer biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudige manier.

Een eencellig micro-organisme is gemakkelijk te manipuleren, te kloneren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Door de mogelijkheid om eenvoudige post-translationele modificaties uit te voeren aan het verkregen recombinante eiwit is het kweken van eiwitten in eukaryotische cellen een veel gebruikte techniek. Ook zijn er tegenwoordig speciaal ontwikkelde bacteriestammen te verkrijgen die gespecialiseerd zijn in het uitvoeren van een bepaalde modificatie.

Toch zijn vaak deze post-translationele modificaties uitgevoerd door bacteriën niet voldoende bij het tot expressie brengen van grote eiwitten (> 70 kDa), zeer gecompliceerde eiwitten en moeilijk oplosbare eiwitten. Dan kan worden uitgeweken naar een andere methode.

Andere mogelijkheden
Behalve het kweken in bacteriën zijn er natuurlijk nog andere methodes zoals het kweken in gist, insectcellen en zoogdiercellen. Iedere mogelijkheid heeft zijn voordelen en nadelen, maar welke zijn dat dan? Het tot expressie brengen van eiwit in bacteriën en gist heeft als grote voordeel dat het snel is en grote hoeveelheden oplevert, met als groot nadeel de kwaliteit. Dit in tegenstelling tot het in expressie brengen in insectencellen of zoogdiercellen. Hier is de hogere kwaliteit een voordeel. 

 
Welk expressie systeem er het beste gebruikt kan worden hangt af van de eisen die gesteld zijn aan het eiwit, het soort eiwit, de grootte en de uiteindelijke toepassing waar het eiwit voor gebruikt gaat worden. Wordt er gekozen voor een hoge opbrengst en is het eiwit niet te groot en goed oplosbaar, dan zal expressie in bacteriën of gist de meest optimale en snelste methode zijn.

Zodra het gaat om een groter eiwit dat moeilijker oplosbaar is en dus vraagt om goede post-translationele modificaties, kan beter gekozen worden voor expressie in insectencellen of zoogdiercellen.

Biotinyleren van antilichamen, wat is de beste methode?

Biotinyleren is het covalent binden van biotine aan een antilichaam, eiwit of ander molecuul. Het is een snelle, specifieke en bijna onbreekbare binding die geringe invloed heeft op de biologische werking van het antilichaam. Biotine bindt aan streptavidine en avidine met zeer hoge affiniteit en specificiteit, waardoor deze verbinding veelvuldig gebruikt wordt in de biotechnologie. Door de binding van meerdere biotine moleculen aan een antilichaam bestaat de mogelijkheid tot meerdere verbindingen met bijvoorbeeld streptavidine, met tot gevolg een hogere gevoeligheid.

Biotinyleren kan op twee manieren; chemisch en enzymatisch. De enzymatische conjugering resulteert in de biotinylering van een specifieke lysine in het antilichaam. De chemische biotinylatie maakt gebruik van bijvoorbeeld de NHS-koppeling van primaire amines in het antilichaam. Wanneer de bindinsplaats van de biotine geplaatst is onder het eiwitoppervlak is er de mogelijkheid gebruik te maken van een linker.

Er zijn commerciële kits verkrijgbaar die antilichamen binnen 20 minuten chemisch conjugeren. Hiervoor is niet veel achtergrondkennis nodig om het toe te kunnen passen. Zelf conjugeren is ook een optie. Wat zijn de voordelen van zelf conjugeren ten opzicht van commerciële kits?

Nanobodies, de toekomst?

De hybridoma techniek, ontdekt in 1975 door Kohler en Milstein, opende de deur voor therapeutische monoclonale antilichamen. In 2005 waren er 18 therapeutische monoclonale antilichamen, in 2010 >30% van alle medicijnen.

Op dit moment wordt er hard gewerkt aan nanobodies, de opvolger van de monoclonale antilichamen. De nanobody wordt gekweekt in kamelen of lama’s. De nanobody is kleiner (25 kDa) en bevatten grote voordelen ten opzichte van het monoclonale antilichaam (150 kDa). Monoclonale antilichamen hebben veel voordelen; hoge affiniteit en selectiviteit en geringe toxiciteit. Nanobodies hebben naast deze eigenschappen nog meer voordelen; door de geringe grootte kunnen ze makkelijker het weefsel in en hebben ze de mogelijkheid om verborgen epitopen op te sporen. Ze zijn goed oplosbaar en hebben niet de neiging om aggregaten te vormen.

Kortom veel voordelen ten opzichte van het monoclonale antilichaam. Wordt de nanobody de toekomst?

Verdwijnt het PCR-en uit de laboratoriumwereld?

De polymerase-kettingreactie (PCR) is ontwikkeld in 1983. Deze moleculair-biologische laboratoriumtechniek waarmee een specifiek stuk nucleïnezuur (DNA of RNA) wordt geamplificeerd, lijkt niet meer weg te denken uit de huidige laboratoria. Sequencing is de veelgebruikte vervolgstap na PCR. Hiermee kan de volgorde van de nucleïne basen worden bepaald.
Er is een nieuwe Next Generation Sequencing techniek die toe staat dat de uitvoering van de PCR niet nodig is tijdens DNA sequencing. In de figuur wordt de PCR vrije Next Generation Sequencing methode schematisch beschreven.


Zou dit het eind kunnen betekenen van het PCR-tijdperk?