Beschikbare methodes voor eiwitexpressie

Eiwitten spelen een belangrijke rol in veel verschillende biologische processen. Om een eiwit te bestuderen is er vaak een grote hoeveelheid van het eiwit nodig. Wat zijn de mogelijkheden om een grote hoeveelheid eiwit te verkrijgen? Is er verschil in opbrengst en kwaliteit van het eiwit na het tot expressie brengen door een methode? En in hoeverre zijn post-translationele modificaties belangrijk voor de oplosbaarheid van het eiwit? Hier wordt beschreven wat de mogelijkheden zijn en hun voor- en nadelen.

Eiwitexpressie in bacteriën
Eiwitexpressie in bacteriën is de meest bekende, gemakkelijkste en meest gebruikte vorm van eiwitexpressie. Eiwitexpressie in een microbiële eukaryotische gastheer biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudige manier.

Een eencellig micro-organisme is gemakkelijk te manipuleren, te kloneren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Door de mogelijkheid om eenvoudige post-translationele modificaties uit te voeren aan het verkregen recombinante eiwit is het kweken van eiwitten in eukaryotische cellen een veel gebruikte techniek. Ook zijn er tegenwoordig speciaal ontwikkelde bacteriestammen te verkrijgen die gespecialiseerd zijn in het uitvoeren van een bepaalde modificatie.

Toch zijn vaak deze post-translationele modificaties uitgevoerd door bacteriën niet voldoende bij het tot expressie brengen van grote eiwitten (> 70 kDa), zeer gecompliceerde eiwitten en moeilijk oplosbare eiwitten. Dan kan worden uitgeweken naar een andere methode.

Andere mogelijkheden
Behalve het kweken in bacteriën zijn er natuurlijk nog andere methodes zoals het kweken in gist, insectcellen en zoogdiercellen. Iedere mogelijkheid heeft zijn voordelen en nadelen, maar welke zijn dat dan? Het tot expressie brengen van eiwit in bacteriën en gist heeft als grote voordeel dat het snel is en grote hoeveelheden oplevert, met als groot nadeel de kwaliteit. Dit in tegenstelling tot het in expressie brengen in insectencellen of zoogdiercellen. Hier is de hogere kwaliteit een voordeel. 

 
Welk expressie systeem er het beste gebruikt kan worden hangt af van de eisen die gesteld zijn aan het eiwit, het soort eiwit, de grootte en de uiteindelijke toepassing waar het eiwit voor gebruikt gaat worden. Wordt er gekozen voor een hoge opbrengst en is het eiwit niet te groot en goed oplosbaar, dan zal expressie in bacteriën of gist de meest optimale en snelste methode zijn.

Zodra het gaat om een groter eiwit dat moeilijker oplosbaar is en dus vraagt om goede post-translationele modificaties, kan beter gekozen worden voor expressie in insectencellen of zoogdiercellen.

Advertenties

Biotinyleren van antilichamen, wat is de beste methode?

Biotinyleren is het covalent binden van biotine aan een antilichaam, eiwit of ander molecuul. Het is een snelle, specifieke en bijna onbreekbare binding die geringe invloed heeft op de biologische werking van het antilichaam. Biotine bindt aan streptavidine en avidine met zeer hoge affiniteit en specificiteit, waardoor deze verbinding veelvuldig gebruikt wordt in de biotechnologie. Door de binding van meerdere biotine moleculen aan een antilichaam bestaat de mogelijkheid tot meerdere verbindingen met bijvoorbeeld streptavidine, met tot gevolg een hogere gevoeligheid.

Biotinyleren kan op twee manieren; chemisch en enzymatisch. De enzymatische conjugering resulteert in de biotinylering van een specifieke lysine in het antilichaam. De chemische biotinylatie maakt gebruik van bijvoorbeeld de NHS-koppeling van primaire amines in het antilichaam. Wanneer de bindinsplaats van de biotine geplaatst is onder het eiwitoppervlak is er de mogelijkheid gebruik te maken van een linker.

Er zijn commerciële kits verkrijgbaar die antilichamen binnen 20 minuten chemisch conjugeren. Hiervoor is niet veel achtergrondkennis nodig om het toe te kunnen passen. Zelf conjugeren is ook een optie. Wat zijn de voordelen van zelf conjugeren ten opzicht van commerciële kits?