Op zoek naar een microtiter plaat, maar wat is nu de beste?

De 96-wells plaat is misschien wel de meest gebruikte plaat die gebruikt wordt in de laboratoria. De plaat is verkrijgbaar in losse strips, afbreekbare strips, platte en ronde bodems. Tevens heeft de coating van de de plaat ook invloed op de resultaten van de assay. Welke plaat er ook gekozen wordt, er zijn verschillende keuzes die nu gemaakt moeten worden om de juiste coating te kiezen om het target te binden.

Plaat coating

Om het target te binden is het van belang om de juiste coating op de plaat te gebruiken. Een passieve coating heeft een brede range aan mogelijkheden omdat deze verschillende biomoleculen kan binden, gebaseerd op verschillende zwakke molecuul interacties. Deze verschillende interacties vormen samen een sterke binding aan het biomolecuul. Passieve coating is daarom primair bruikbaar voor middelgrote tot grote biomoleculen, zoals antilichamen. De exacte hoeveel moleculaire bindingsplaatsen is afhankelijk van het te binden biomolecuul, en de interactie met de coating. Bij een grote verscheidenheid aan biomoleculen wordt gebruik gemaakt van de passieve binding om het biomolecuul stabiel te binden.

De passieve coating is onder te verdelen in 4 verschillende subgroepen op basis van hydrofibiciteit; Hydrofoob, licht hydrofofiel, hydrifiel en sterk hydrofiel.

Hydrofoob
De hydrofobe coating wordt gebruikt voor de binden van biomoleculen rijk aan lipides.

Weinig hydrofiel
De licht hydrofiele coating vergroot de range aan biomoleculen die gebonden kunnen worden, inclusief glyco-eiwitten en lipopolysaccharides in serum, of serum samples. Met deze coating wordt de a-specifieke binding geminimaliseerd om de signal-to-noise (S/N) ratio te verhogen en hierdoor de gevoeligheid te vergroten.

Hydrofiel
De hydrofiele coating is geoptimaliseerd om grote hoeveelheden IgG te binden, wat deze platen uiterst geschikt maakt voor het gebruik in antilichaam sandwich assay’s, bijvoorbeeld ELISA. Verder heeft deze coating de mogelijkheid om een grote variëteit aan biomoleculen te binden die hydrofiele/hydrofobe karakteristieken hebben.

Sterk hydrofiel
Deze coating bindt in water oplosbare eiwitten en glycanen, maar de binding is pH gevoelig.

Overzicht bindingscapaciteit Nunc platen (Bron; ThermoFisher).

           

 

 

 

 

 

Welke plaat is het beste geschikt voor uw experiment? Komt u er niet uit? Vraag een sample aan via tech@sanbio.nl.

Advertenties

ImmunoFluorescentie Assay, een goede manier om tissue te kleuren

Immunofluorescentie (IFA) is een techniek waarmee het verkregen weefsel direct wordt gekleurd en bekeken kan worden met behulp van een fluorescentie microscoop. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die fluorescent gelabeld zijn, en binden aan het biologische antigeen in het celweefsel. IFA wordt veel gebruikt in de immunohistochemie. IFA kan gebruikt worden op celweefsel, gekweekte cellijnen en individuele cellen.

Methodes

Binnen de IFA bestaan er twee methodes; de directe en de indirecte techniek. Tijdens de directe methode wordt het gelabelde antilichaam direct gekoppeld aan het target in de cel, dat het mogelijk maakt om deze uit te lezen met de fluorescentie microscoop. Voordelen van deze methode zijn de korte stappen, snelle procedure, minder last van kruisreactiviteit en hoge mate van specificiteit. Nadeel is de mindere gevoeligheid doordat er minder antilichamen gebonden kunnen worden aan het antigeen dan met de indirecte methode.

Tijdens de indirecte methode wordt wordt eerst een primair antilichaam gekoppeld aan het antigeen waarna er een fluorescent gelabeld secundair antilichaam gekoppeld kan worden aan het primaire antilichaam. Deze methode is gevoeliger omdat er meerdere secundaire antilichamen gekoppeld kunnen worden aan het primaire antilichaam, maar deze methode is complexer en kost meer tijd.

Aan deze techniek zitten wat beperkingen. Verlies in activiteit kan veroorzaakt worden door het blootstellen van de gelabelde cellen aan licht. Dit kan beïnvloed worden door de cellen een kortere tijd bloot te stellen aan licht, een verhoogde concentratie conjugaat te gebruiken of labels te gebruiken die beter bestand zijn tegen licht (bijvoorbeeld Dylight, Alexa Fluors). Immunofluorencentie werkt alleen op gefixeerde, dode cellen omdat antilichamen niet door het celmembraan kunnen.

Zeus Hep 2 guide