ELISA, zelf ontwikkelen of een kant-en-klare kit?

De ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) is gebaseerd op een immunochemische reactie. Alle immunochemische bepalingen hebben hetzelfde principe: de specifieke binding tussen antigeen en antistof. Door het aantonen van dit complex in bloed, serum of andere lichaamsvloeistof van mens of dier is het mogelijk bij te dragen aan de diagnose van een infectieziekte of een autoimmuunziektePrincipe van de ELISA.

Zelf een ELISA ontwikkelen is een optie, maar voor steeds meer bepalingen is er een commerciele kit verkrijgbaar. Wat zijn de voor- en nadelen van zelf een ELISA ontwikkelen? Hoeveel tijd neemt het in beslag? Aan welke eisen moet een ELISA voldoen? Is het van belang de “low affinity” antibodies te meten? Is het nog wel interessant om zelf een ELISA te ontwikkelen?

Advertenties

Cytokeratines, dé tool in cytopathologie en cytometrische testen.

Cytokeratines

Cytokeratines (CK) zijn keratine bevattende eiwitten in de intermediaire filamenten welke gevonden worden in het intracytoplasmatisch cytoskelet van epitheel cellen.
De term cytokeratines wordt gebruikt sinds de jaren ’70, toen de subunits van de keratine ontdekt werden in de cellen. In 2006 is een nieuwe systematische naamgeving (CK1 t/m CK20) vanwege de biochemische diversiteit van de verschillende keratines. CK1 heeft het hoogste molecuulgewicht en hoogste isoelectrisch punt, terwijl CK19 het laagste molecuulgewicht en isoelectrisch punt heeft. Ze zijn opgedeeld in type I en type II sub klasse. De type I zijn de cytokeratines, genummerd CK9 t/m CK20, met een lage pH. De type II, genummerd CK1 t/m CK8, zijn basisch to pH neutraal.

Deze slideshow heeft JavaScript nodig.

Celbiologie

In het cytoplasma, vormen de keratine filamenten een complex netwerk welke reikt van de celkern tot aan het celmembraan. Verschillende complementaire eiwitten spelen een rol in het ontstaan en de handhaving van dit complex. 
Deze verbinding tussen het celmembraan en de celkern levert belangrijke informatie over het cytoplasma en de cellulaire communicatie. Uit verschillende studies is gebleken dat de keratines een rol spelen in de celmitose, de differentiatie en het voortbewegen van de cel.
De intermediaire filamenten van de eukaryotische cytoskelet, van welke cytokeratines één van de drie bestandsdelen is, zijn geassocieerd met het ankyrine en spectrine complex welke zich net onder het celmembraan bevindt.

 Diagnostiek

Intermediaire filamenten komen voor in vrijwel iedere cel van het menselijk lichaam en zijn een wezenlijk onderdeel van het cytoskelet. De filamenten zijn specifiek voor een weefsel, waardoor ze met behulp van antilichaam gericht tegen het intermediaire filamenteiwit epithiale, mesenchymale, spier-, zenuw- en gliacellen van elkaar kunnen onderscheiden. Dit geldt niet alleen voor gezond weefsel maar ook voor kwaadaardig weefsel en metastasen daarvan.
Antilichamen gericht tegen intermediaire filamenten kunnen belangrijke bijdrage leveren aan de differentiële diagnostiek van tumoren bij de mensen doordat met immunohistochemie op vriescoupes van operatiepreparaten en in uitstrijkpreparaten van sputum, urine of met de dunne naald geaspireerd weefsel de intermediaire filamenten zichtbaar gemaakt kunnen worden.

Biotinyleren van antilichamen, wat is de beste methode?

Biotinyleren is het covalent binden van biotine aan een antilichaam, eiwit of ander molecuul. Het is een snelle, specifieke en bijna onbreekbare binding die geringe invloed heeft op de biologische werking van het antilichaam. Biotine bindt aan streptavidine en avidine met zeer hoge affiniteit en specificiteit, waardoor deze verbinding veelvuldig gebruikt wordt in de biotechnologie. Door de binding van meerdere biotine moleculen aan een antilichaam bestaat de mogelijkheid tot meerdere verbindingen met bijvoorbeeld streptavidine, met tot gevolg een hogere gevoeligheid.

Biotinyleren kan op twee manieren; chemisch en enzymatisch. De enzymatische conjugering resulteert in de biotinylering van een specifieke lysine in het antilichaam. De chemische biotinylatie maakt gebruik van bijvoorbeeld de NHS-koppeling van primaire amines in het antilichaam. Wanneer de bindinsplaats van de biotine geplaatst is onder het eiwitoppervlak is er de mogelijkheid gebruik te maken van een linker.

Er zijn commerciële kits verkrijgbaar die antilichamen binnen 20 minuten chemisch conjugeren. Hiervoor is niet veel achtergrondkennis nodig om het toe te kunnen passen. Zelf conjugeren is ook een optie. Wat zijn de voordelen van zelf conjugeren ten opzicht van commerciële kits?

Nanobodies, de toekomst?

De hybridoma techniek, ontdekt in 1975 door Kohler en Milstein, opende de deur voor therapeutische monoclonale antilichamen. In 2005 waren er 18 therapeutische monoclonale antilichamen, in 2010 >30% van alle medicijnen.

Op dit moment wordt er hard gewerkt aan nanobodies, de opvolger van de monoclonale antilichamen. De nanobody wordt gekweekt in kamelen of lama’s. De nanobody is kleiner (25 kDa) en bevatten grote voordelen ten opzichte van het monoclonale antilichaam (150 kDa). Monoclonale antilichamen hebben veel voordelen; hoge affiniteit en selectiviteit en geringe toxiciteit. Nanobodies hebben naast deze eigenschappen nog meer voordelen; door de geringe grootte kunnen ze makkelijker het weefsel in en hebben ze de mogelijkheid om verborgen epitopen op te sporen. Ze zijn goed oplosbaar en hebben niet de neiging om aggregaten te vormen.

Kortom veel voordelen ten opzichte van het monoclonale antilichaam. Wordt de nanobody de toekomst?