Prosthetic Joint Infections (PJI), nu serologisch te bepalen

Het vervangen van een gewricht is een hele operatie, vaak bedoeld om de mobiliteit te vergroten. Maar wat als er na de operatie een infectie ontstaat? Infecties die geassocieerd worden met een gewrichtsoperatie komen niet zo vaak voor, maar zorgen voor de meest verwoestende complicaties. Naast langdurige ziekenhuisopname, risico op complicaties als gevolg van extra chirurgische behandelingen en de mogelijkheid van een hernieuwde handicap.

BJI InoplexMet de komst van de nieuwe BJI Inoplex test kunnen infecties eerder worden opgepikt. Het is bedoeld als hulpmiddel bij de detectie van orthopedische infecties, naast de reeds bestaande methoden (zoals CRP of radiografie) die geen operatieve handeling vereisen. De test is een non-invasieve test op basis van de immuunrespons van patiënten, die verdacht worden orthopedische infecties te hebben en met pijnklachten terugkomen in de kliniek. Deze patiënten zijn veelal kandidaat voor revisie chirurgie. Een goede diagnose voorafgaande aan de operatie kan van groot belang zijn om een goed behandelingstraject te bepalen.

De BJI Inoplex test is een multiplex assay die bestaat uit een panel van 16 antigenen die zijn geïsoleerd uit de meest voorkomende pathogenen die orthopedische infecties kunnen veroorzaken. De antigenen zijn gekoppeld aan microscopische beads op basis van de Luminex Technologie, die reageren met IgG antistoffen in het serum van de patiënt.

Advertenties

Join the resolution!

Het uitvoeren van de Southern blot is een lange en arbeidsintensieve bepaling waar veel valkuilen in zitten. Met de nieuwe mogelijkheden op het gebied van moleculaire testen is het nu mogelijk om deze methode over te slaan voor het bepalen van afwijkingen in het Fragiele X gen.

Fragiele X gen

Het fragiele-X-syndroom is een erfelijke aandoening welke gepaard gaat met een verstandelijk handicap. Het wordt veroorzaakt in een mutatie in het FMR1 gen. Dit FMR1 gen bevat meer dan 200 CGG repeats (herhalingen). Een mutatie in dit gen veroorzaakt het fragiele-X-syndroom. Deze mutatie zet zich eindeloos voort en wanneer dit meer dan 200 herhaling heeft kan het gen niet meer normaal functioneren.

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Detectie

Sinds ’91 wordt het de status van het gen bepaald met behulp van de Southern Blot. Maar zoals eerder beschreven is dit een arbeidsintensieve behandeling, die ook een grote hoeveelheden DNA nodig heeft, slechte gevoeligheid en resolutie heeft vergeleken met de nieuwe PCR methode. Methodes om de gemethyleerde status van het gen te bepalen zonder Southern Blot zijn gebaseerd op chemische of enzymatische voorbehandelingsmethodes van het DNA voor PCR.

Chemische voorbehandeling vereist Natrium BiSulfite om het gemethyleerde Cytosine om te zetten naar Uracil. Deze omzetting kan gemeten worden verschillende technieken inclusief DNA sequencing, PCR en melting curve analyse. Deze methodes zijn meer bruikbaar voor het diagnosticeren van mannelijk DNA omdat de aanwezigheid van 2 X-chromosomen in vrouwelijk DNA de bepaling kan verstoren.

Enzymatische voorbehandeling

De enzymatische voorbehandeling maakt gebruik van methyl gevoelige restrictie enzymen die het ongemethyleerde DNA verteren. Meerdere technieken kunnen hierna gebruikt worden om de gemethyleerde status van het gen te bepalen door het vergelijken van de amplicons van verteerde en onverteerde DNA. Voorbeelden hiervan zijn PCR, het werken met probes of capillaire electroforese.

Recente methodes hebben laten zien dat de enzymatische voorbehandeling in combinatie met complete amplificatie van het FMR1 CGG herhalingen een nauwkeurig beeld geven van zowel mannelijk als vrouwelijk DNA.

bron: www.nomoresouthernblots.com

MBL, een deel van het afweersysteem

Het mensenlijk lichaam wordt dagelijks aangevallen door 10-duizenden lichaamsvreemde moleculen, deze worden door ons immuunsysteem verwijderd zonder dat we er iets van merken. Ons immuunsysteem is opgebouwd uit een groot aantal cellen en moleculen. Deze werken door interactie in lymfoïde organen samen aan het afweren van lichaamsvreemde moleculen. Het immuunsysteem is opgebouwd uit een aangeboren, niet specifiek systeem, en een aangeleerd, specifiek systeem. Het aangeboren systeem is de “first line of defence”. Het aangeleerde systeem heeft geheugen cellen, deze cellen herkennen een lichaamsvreemd molecuul en kunnen meteen de juiste antilichamen laten produceren om het molecuul te verwijderen.

Het aangeboren systeem bestaat uit verschillende cellen in ons bloed, zoals granulocyten, monocyten, macrofagen, dendritische cellen en Natural-Killer cellen (NKcellen). Deze hebben ieder zijn eigen taak in het niet-specifieke systeem.
Naast deze cellulaire factoren zijn er ook humorale factoren die een invloed hebben op dit systeem. Deze factoren worden het complement systeem genoemd.

Afb 1: Complement system, provided by Hycult Biotech, Uden

 In dit complement systeem zijn 3 verschillende routes, de klassieke route, de alternatieve route en de Manose Binding Lectin (MBL) route. Al deze verschillende routes activeren het complement systeem wat als doel heeft het lichaamsvreemde molecuul  te fagocyteren.

Naast het aangeboren, niet specifieke systeem is het immuunsysteem ook opgebouwd uit het aangeleerde, specifieke systeem. In dit systeem zijn T-cellen de belangrijkste cellen, deze zorgen voor de cellulaire immuniteit. De B-cellen zorgen voor de humorale immuniteit. Dit systeem is in het bezit van memory cellen, die bij herkenning van het lichaamsvreemde molecuul meteen het juiste antilichaam kunnen laten produceren. Hierdoor wordt het lichaamsvreemde molecuul snel verwijderd. Doordat er veel verschillende lichaamsvreemde moleculen ons lichaam aanvallen zijn er ook veel verschillende memory cellen.

Figure 2: Membrane Attack Complex (MAC)

In het klassieke systeem bindt het C1-complex aan de lichaamsvreemde stof (zie afbeelding 1). Na activatie van het complement systeem volgt er een cascade met moleculen die binden aan het lichaamsvreemde molecuul met als uiteindelijk resultaat de vorming van het MAC (Membrane Attack Complex, Afb 2). Hierdoor ontstaan er gaten in het celmembraan en wordt de lichaamsvreemde cel gefagocyteerd.Het complement systeem wordt geactiveerd zodra er een lichaamsvreemde stof is gedetecteerd. Het complement systeem omvat verschillende plasma’s en membraaneiwitten die een taak hebben bij de verdediging tegen deze lichaamsvreemde stof.

MBL is een serum eiwit die het complement systeem kan activeren. In verschillende artikelen is bewezen dat de MBL route een grote regulator is van het complement systeem. Doordat MBL bindt aan de lichaamsvreemde stof met behulp van mannose wordt de MBL route geactiveerd en de lichaamsvreemde cel uiteindelijke gefagocyteerd. MBL lijkt op C1q, het eiwit dat aan de start staat van de klassieke route. 

Belangrijke factoren die het belang van onderzoek naar MBL stimuleren zijn:

  • Het is de meest voorkomende immuundeficiency
  • Het is een risicofactor in combinatie met autoimmuun afwijking
  • Heeft een verband met verhoogd risico of scepsis.

Veel pasgeborene of te vroeg geborene hebben veel kans op infecties. Uit verschillende artikelen blijkt dat een afwijking in de MBL route hier een grote oorzaak in speelt. Uit onderzoek blijkt dat 40% van de onderzochte pasgeborene een te laag MBL gehalte had.(Low mannose-binding lectin (MBL) levels in neonates with pneumonia and sepsis, Frakking et all, 2007). Lage concentraties MBL vlak na de geboorte wordt geassocieerd met een verhoogde kans op de ontwikkeling van pneumonia en bevestigde bloedvergiftiging door een bacterie door een verlaagde capaciteit van fagocytose of opsonisatie van het lichaamsvreemde molecuul.

Is het zinvol om alle pasgeborene te testen op afwijking in de MBL route? Of is het alleen van toepassing op prematuur geborene?

Cytokeratines, dé tool in cytopathologie en cytometrische testen.

Cytokeratines

Cytokeratines (CK) zijn keratine bevattende eiwitten in de intermediaire filamenten welke gevonden worden in het intracytoplasmatisch cytoskelet van epitheel cellen.
De term cytokeratines wordt gebruikt sinds de jaren ’70, toen de subunits van de keratine ontdekt werden in de cellen. In 2006 is een nieuwe systematische naamgeving (CK1 t/m CK20) vanwege de biochemische diversiteit van de verschillende keratines. CK1 heeft het hoogste molecuulgewicht en hoogste isoelectrisch punt, terwijl CK19 het laagste molecuulgewicht en isoelectrisch punt heeft. Ze zijn opgedeeld in type I en type II sub klasse. De type I zijn de cytokeratines, genummerd CK9 t/m CK20, met een lage pH. De type II, genummerd CK1 t/m CK8, zijn basisch to pH neutraal.

Deze slideshow heeft JavaScript nodig.

Celbiologie

In het cytoplasma, vormen de keratine filamenten een complex netwerk welke reikt van de celkern tot aan het celmembraan. Verschillende complementaire eiwitten spelen een rol in het ontstaan en de handhaving van dit complex. 
Deze verbinding tussen het celmembraan en de celkern levert belangrijke informatie over het cytoplasma en de cellulaire communicatie. Uit verschillende studies is gebleken dat de keratines een rol spelen in de celmitose, de differentiatie en het voortbewegen van de cel.
De intermediaire filamenten van de eukaryotische cytoskelet, van welke cytokeratines één van de drie bestandsdelen is, zijn geassocieerd met het ankyrine en spectrine complex welke zich net onder het celmembraan bevindt.

 Diagnostiek

Intermediaire filamenten komen voor in vrijwel iedere cel van het menselijk lichaam en zijn een wezenlijk onderdeel van het cytoskelet. De filamenten zijn specifiek voor een weefsel, waardoor ze met behulp van antilichaam gericht tegen het intermediaire filamenteiwit epithiale, mesenchymale, spier-, zenuw- en gliacellen van elkaar kunnen onderscheiden. Dit geldt niet alleen voor gezond weefsel maar ook voor kwaadaardig weefsel en metastasen daarvan.
Antilichamen gericht tegen intermediaire filamenten kunnen belangrijke bijdrage leveren aan de differentiële diagnostiek van tumoren bij de mensen doordat met immunohistochemie op vriescoupes van operatiepreparaten en in uitstrijkpreparaten van sputum, urine of met de dunne naald geaspireerd weefsel de intermediaire filamenten zichtbaar gemaakt kunnen worden.

Het Ph chromosoom, het genetisch defect bij chronische myeloide leukemie (CML)

Chronisch myeloide leukemie (CML) is een vorm van leukemie waarbij witte bloedcellen in overmaat worden geproduceerd. Bij de grote meerderheid wordt het Philadelphia chromosoom gevonden. Het Ph chromosoom is verantwoordelijk voor de codering van BCR-ABL1.

Na de ontdekking van CML, meer dan 150 jaar geleden is er weinig tot geen progressie gemaakt met betrekking tot de genezing. Bestraling zorgde alleen voor een betere levenskwaliteit. De genezingskansen werden groter met de behandeling met Hydroxyurea (HU), en daarna nog groter met allogene hematopoietische stamcel transplantatie.

Het begrijpen van de ziekte begon met de ontdekking van het Philadelphia (Ph) chromosoom. De aanwezigheid van de Ph chromosoom is het gevolg van een genetische translocatie van de chromosomen 9 en 22. De ontdekking van het Ph chromosoom betekende ook de ontdekking van de BCR/ABL1 eiwitten, wat heeft geleid tot nieuwe onderzoeken. Door componenten te ontwikkelen die de activiteit van de tyrokinase verminderen, en dus de ontwikkeling van de ziekte remmen, is er een grote stap gezet in de ontwikkeling van een medicijn.

Detectie methode
Recent is er een nieuwe methode op de markt gekomen om dit Ph chromosoom te detecteren. Bij deze methode wordt een qPCR gecombineerd met een ELISA waarbij gebruik gemaakt wordt van beads. Dit biedt mogelijkheid om meerdere samples tegelijkertijd te testen met een hoge gevoeligheid, de detectie limiet ligt op 1 leukemie cel per 100.000 normale cellen . Door het monitoren van de tyrosine kinase inhibitor (TKI) ontstaat er een goede indicatie over de progressie van de ziekte.

Biotinyleren van antilichamen, wat is de beste methode?

Biotinyleren is het covalent binden van biotine aan een antilichaam, eiwit of ander molecuul. Het is een snelle, specifieke en bijna onbreekbare binding die geringe invloed heeft op de biologische werking van het antilichaam. Biotine bindt aan streptavidine en avidine met zeer hoge affiniteit en specificiteit, waardoor deze verbinding veelvuldig gebruikt wordt in de biotechnologie. Door de binding van meerdere biotine moleculen aan een antilichaam bestaat de mogelijkheid tot meerdere verbindingen met bijvoorbeeld streptavidine, met tot gevolg een hogere gevoeligheid.

Biotinyleren kan op twee manieren; chemisch en enzymatisch. De enzymatische conjugering resulteert in de biotinylering van een specifieke lysine in het antilichaam. De chemische biotinylatie maakt gebruik van bijvoorbeeld de NHS-koppeling van primaire amines in het antilichaam. Wanneer de bindinsplaats van de biotine geplaatst is onder het eiwitoppervlak is er de mogelijkheid gebruik te maken van een linker.

Er zijn commerciële kits verkrijgbaar die antilichamen binnen 20 minuten chemisch conjugeren. Hiervoor is niet veel achtergrondkennis nodig om het toe te kunnen passen. Zelf conjugeren is ook een optie. Wat zijn de voordelen van zelf conjugeren ten opzicht van commerciële kits?

CE markering voor disposable IVF producten?

Inmiddels is bekend dat de wetgeving voorschrijft om in een IVF laboratorium disposable producten te gebruiken die een CE-markering dragen volgens de Richtlijn Medische Hulpmiddelen (MDD: 93/42/EEC).

Een aantal leveranciers zijn ingesprongen op deze eis en leveren reeds producten die aanvullend getest zijn met bijv. een Mouse-Embryo Assay (MEA) en in sommige gevallen een humaan Sperma Overlevingstest (hSOT). Dit naast de gebruikelijke kwaliteitstesten voor steriliteit en non-pyrogeniteit, om op deze manier de veiligheid van embryo’s en gameten die in aanraking komen met de disposables, zoveel mogelijk te kunnen waarborgen.

Vaak is het onduidelijk of producten met CE-markering wel voldoen aan de juiste eisen gesteld in de MDD, of waar de CE-markering precies op is gebaseerd. Ook worden er nog regelmatig disposables gebruikt zonder CE-markering, simpelweg omdat er nog geen alternatief voor bestaat wat wel CE-gemarkeerd is.

Hoe groot is het risico om disposables zonder CE-markering in de laboratoria te gebruiken? En hoe gaan we om met alle onduidelijkheid rondom deze CE-markering?