De WeLLevator™, de tool voor gemakkelijk pipetteren in een 96 wells plaat

Veel testen op het lab worden tegenwoordig gedaan in 96-wells platen, waarbij veel gebruik gemaakt wordt van een zogenaamde multichannel pipet. Met deze pipet kunnen 8- of 12-welletjes gevuld worden. Gebruik van deze pipet is vaak lastig omdat er meerdere wells tegelijkertijd gepipetteerd worden.

Wellevator

Vaak is het een uitdaging om de pipetpunten juist uit te lijnen in en 96 wells plaat waardoor bijvoorbeeld de cellen of de pellet geraakt wordt. Dit kan klachten aan de pols als gevolg hebben. Met de komst van de WeLLevator™ kunt u dit probleem tackelen.

Wellevator-1Door de WeLLevator te gebruiken kunnen deze problemen verholpen worden. De pipet kan rusten op de WeLLevator, met als gevolg dat u nergens de pellet of de cellen raakt en geen last van uw pols. In combinatie met een magneet kan de WeLLevator gebruikt worden voor testen met magentische beads.

Voordelen

Gebruik van de WeLLevator heeft als grote voordeel dat er consistente resultaten worden behaald, en zekerheid dat alle wells hetzelfde behandeld worden. Ook de verminderde kans op problemen met de gewrichten, en de mogelijkheid om met magnetische beads te werken zijn grote voordelen.

Advertenties

Microsatellite Instability (MSI)

Darmkanker is een van de meest voorkomende ziektes in de westerse wereld. Ondanks verbeteringen in operatietechnieken en chemotherapie zijn de vooruitzichten niet significant verbeterd in de laatste jaren.

Ondanks verschillende onderzoeken naar dieetfactoren, is de meest voor de hand liggende oorzaak, erfelijkheid, weinig onderzocht. De kennis over erfelijke factoren van kanker is schaars. Dit terwijl de oorzaak van kanker vaker erfelijk is dan is gedacht.

Heredarity nonpolyposis colorectal carcinoma (HNPCC), ook wel Lynch syndroom, is een dominant autosomaal syndroom wat verantwoordelijk is voor 5-10% van alle darmkanker lasten. Het gebrek aan diagnostische karakteristieken heeft gezorgd voor de introductie van bepaalde criteria om een diagnose te kunnen stellen. Deze criteria, Amsterdam criteria I, werden vastgesteld om HNPCC te diagnosticeren.

Er zijn veel onderzoeken gedaan naar de erfelijke factoren van HNPCC waaruit blijkt

PMS2 in colon cancer

PMS2 in colon cancer

dat microsatellite instability (MSI) in sommige gevallen gelinkt kan worden. Eind ’93 werd het verantwoordelijke gen, MSH2, gekloneerd en de mutaties in Lynch syndroom geïdentificeerd. Een tweede gen werd geïdentificeerd in ’94 welke ook werd gelinkt aan Lynch syndroom, MLH1. In de jaren hierna werden ook PMS2 en MSH6 geïdentificeerd als mutaties met Lynch syndroom als gevolg.

DNA replicatie wordt geassocieerd met een eindige error rate, inclusief de incorporatie van  mismatch van baseparen, en het verkeerd aflezen van DNA strengen tijdens duplicatie. Het niet kunnen repareren van deze mismatch resulteert in mutaties. Het DNA MisMatch Repair (MMR) systeem herkent deze fouten tijdens DNA polymerase. Een link tussen MSI en gebrekkige MMR was herkend.

Resultaten van MMR IHC testen vergeleken met MSI testen komen grotendeels overeen. Tijdens een grote studie werd voor het gecombineerd gebruik van MLH1 en MSH2 in IHC een gevoeligheid van 92.3%, en specificiteit van 100% gemeten voor de identificatie van tumoren. De toevoeging van MSH6 en PMS2 aan het IHC panel zou de gevoeligheid moeten verhogen aangezien MSH6 en PMS2 mutaties steeds meer herkend worden als oorzaak van het Lynch syndroom.

Niet alleen het Lynch syndroom maar ook andere kankersoorten kunnen worden herkend met het zogenaamde MSI panel. Dit panel bevat de PMS2, MSH6, MSH2 en de MLH1. Het gebruik van dit panel zou kunnen meewerken aan het onderzoek naar de invloed van erfelijke factoren.

Transfectie en drug delivery

Tecrea is actief in het veld van de basale research. Ze richten zich op het creatief gebruik van nanotechnologie voor de opname van kleine en grote moleculen in de cel.  Doordat veel medicijnen niet door de celwand kunnen is dit één van de problemen in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Met de research naar het verbeteren van de doorgang van de celwand met het intact houden van de werking van de cel ondersteunt Tecrea onderzoek naar nieuwe moderne medicijnen.

Transfectie

Transfectie is het inbrengen van lichaamsvreemde stoffen in een cel met het behoud van de werking van de cel. Tecrea heeft hiervoor HappyFect™ ontwikkeld. HappyFect™ is een revolutionaire nieuw transfectie reagent die plasmides  en andere kleine lichaamsvreemde stoffen in een cel kan brengen zonder de cel te doden of te inactiveren. HappyFect™ kan gebruikt worden in verschillende zoogdiercellen, is niet toxisch en snel. Met behulp van HappyFect™ kan snel en effectief plasmides en siRNA worden ingebracht in de cel.

Drug delivery

Veel bruikbare medicijnen worden niet op de markt gebracht omdat ze niet of slecht de celwand door kunnen. De opname van het medicijn is de belangrijkste, maar moeilijkste punt in de ontwikkeling van een medicijn. Zelfs bestaande medicijnen zouden nog beter kunnen werken wanneer de opname door de cel beter is. Met NanoCargo™ kunnen grotere eiwitten en moleculen worden opgenomen door de cel.

Nanotechnolgie

Bij onderzoek naar onder andere medicijnen wordt steeds meer naar details gekeken. Waar microtechnologie de toekomst was zijn we nu vooral geinteresseerd in de nog kleinere details van de cel. Met behulp van nanotechnologie kan nog beter in kaart worden gebracht hoe de mechanismes in het lichaam werken.

Op zoek naar een microtiter plaat, maar wat is nu de beste?

De 96-wells plaat is misschien wel de meest gebruikte plaat die gebruikt wordt in de laboratoria. De plaat is verkrijgbaar in losse strips, afbreekbare strips, platte en ronde bodems. Tevens heeft de coating van de de plaat ook invloed op de resultaten van de assay. Welke plaat er ook gekozen wordt, er zijn verschillende keuzes die nu gemaakt moeten worden om de juiste coating te kiezen om het target te binden.

Plaat coating

Om het target te binden is het van belang om de juiste coating op de plaat te gebruiken. Een passieve coating heeft een brede range aan mogelijkheden omdat deze verschillende biomoleculen kan binden, gebaseerd op verschillende zwakke molecuul interacties. Deze verschillende interacties vormen samen een sterke binding aan het biomolecuul. Passieve coating is daarom primair bruikbaar voor middelgrote tot grote biomoleculen, zoals antilichamen. De exacte hoeveel moleculaire bindingsplaatsen is afhankelijk van het te binden biomolecuul, en de interactie met de coating. Bij een grote verscheidenheid aan biomoleculen wordt gebruik gemaakt van de passieve binding om het biomolecuul stabiel te binden.

De passieve coating is onder te verdelen in 4 verschillende subgroepen op basis van hydrofibiciteit; Hydrofoob, licht hydrofofiel, hydrifiel en sterk hydrofiel.

Hydrofoob
De hydrofobe coating wordt gebruikt voor de binden van biomoleculen rijk aan lipides.

Weinig hydrofiel
De licht hydrofiele coating vergroot de range aan biomoleculen die gebonden kunnen worden, inclusief glyco-eiwitten en lipopolysaccharides in serum, of serum samples. Met deze coating wordt de a-specifieke binding geminimaliseerd om de signal-to-noise (S/N) ratio te verhogen en hierdoor de gevoeligheid te vergroten.

Hydrofiel
De hydrofiele coating is geoptimaliseerd om grote hoeveelheden IgG te binden, wat deze platen uiterst geschikt maakt voor het gebruik in antilichaam sandwich assay’s, bijvoorbeeld ELISA. Verder heeft deze coating de mogelijkheid om een grote variëteit aan biomoleculen te binden die hydrofiele/hydrofobe karakteristieken hebben.

Sterk hydrofiel
Deze coating bindt in water oplosbare eiwitten en glycanen, maar de binding is pH gevoelig.

Overzicht bindingscapaciteit Nunc platen (Bron; ThermoFisher).

           

 

 

 

 

 

Welke plaat is het beste geschikt voor uw experiment? Komt u er niet uit? Vraag een sample aan via tech@sanbio.nl.

ImmunoFluorescentie Assay, een goede manier om tissue te kleuren

Immunofluorescentie (IFA) is een techniek waarmee het verkregen weefsel direct wordt gekleurd en bekeken kan worden met behulp van een fluorescentie microscoop. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die fluorescent gelabeld zijn, en binden aan het biologische antigeen in het celweefsel. IFA wordt veel gebruikt in de immunohistochemie. IFA kan gebruikt worden op celweefsel, gekweekte cellijnen en individuele cellen.

Methodes

Binnen de IFA bestaan er twee methodes; de directe en de indirecte techniek. Tijdens de directe methode wordt het gelabelde antilichaam direct gekoppeld aan het target in de cel, dat het mogelijk maakt om deze uit te lezen met de fluorescentie microscoop. Voordelen van deze methode zijn de korte stappen, snelle procedure, minder last van kruisreactiviteit en hoge mate van specificiteit. Nadeel is de mindere gevoeligheid doordat er minder antilichamen gebonden kunnen worden aan het antigeen dan met de indirecte methode.

Tijdens de indirecte methode wordt wordt eerst een primair antilichaam gekoppeld aan het antigeen waarna er een fluorescent gelabeld secundair antilichaam gekoppeld kan worden aan het primaire antilichaam. Deze methode is gevoeliger omdat er meerdere secundaire antilichamen gekoppeld kunnen worden aan het primaire antilichaam, maar deze methode is complexer en kost meer tijd.

Aan deze techniek zitten wat beperkingen. Verlies in activiteit kan veroorzaakt worden door het blootstellen van de gelabelde cellen aan licht. Dit kan beïnvloed worden door de cellen een kortere tijd bloot te stellen aan licht, een verhoogde concentratie conjugaat te gebruiken of labels te gebruiken die beter bestand zijn tegen licht (bijvoorbeeld Dylight, Alexa Fluors). Immunofluorencentie werkt alleen op gefixeerde, dode cellen omdat antilichamen niet door het celmembraan kunnen.

Zeus Hep 2 guide

MBL, een deel van het afweersysteem

Het mensenlijk lichaam wordt dagelijks aangevallen door 10-duizenden lichaamsvreemde moleculen, deze worden door ons immuunsysteem verwijderd zonder dat we er iets van merken. Ons immuunsysteem is opgebouwd uit een groot aantal cellen en moleculen. Deze werken door interactie in lymfoïde organen samen aan het afweren van lichaamsvreemde moleculen. Het immuunsysteem is opgebouwd uit een aangeboren, niet specifiek systeem, en een aangeleerd, specifiek systeem. Het aangeboren systeem is de “first line of defence”. Het aangeleerde systeem heeft geheugen cellen, deze cellen herkennen een lichaamsvreemd molecuul en kunnen meteen de juiste antilichamen laten produceren om het molecuul te verwijderen.

Het aangeboren systeem bestaat uit verschillende cellen in ons bloed, zoals granulocyten, monocyten, macrofagen, dendritische cellen en Natural-Killer cellen (NKcellen). Deze hebben ieder zijn eigen taak in het niet-specifieke systeem.
Naast deze cellulaire factoren zijn er ook humorale factoren die een invloed hebben op dit systeem. Deze factoren worden het complement systeem genoemd.

Afb 1: Complement system, provided by Hycult Biotech, Uden

 In dit complement systeem zijn 3 verschillende routes, de klassieke route, de alternatieve route en de Manose Binding Lectin (MBL) route. Al deze verschillende routes activeren het complement systeem wat als doel heeft het lichaamsvreemde molecuul  te fagocyteren.

Naast het aangeboren, niet specifieke systeem is het immuunsysteem ook opgebouwd uit het aangeleerde, specifieke systeem. In dit systeem zijn T-cellen de belangrijkste cellen, deze zorgen voor de cellulaire immuniteit. De B-cellen zorgen voor de humorale immuniteit. Dit systeem is in het bezit van memory cellen, die bij herkenning van het lichaamsvreemde molecuul meteen het juiste antilichaam kunnen laten produceren. Hierdoor wordt het lichaamsvreemde molecuul snel verwijderd. Doordat er veel verschillende lichaamsvreemde moleculen ons lichaam aanvallen zijn er ook veel verschillende memory cellen.

Figure 2: Membrane Attack Complex (MAC)

In het klassieke systeem bindt het C1-complex aan de lichaamsvreemde stof (zie afbeelding 1). Na activatie van het complement systeem volgt er een cascade met moleculen die binden aan het lichaamsvreemde molecuul met als uiteindelijk resultaat de vorming van het MAC (Membrane Attack Complex, Afb 2). Hierdoor ontstaan er gaten in het celmembraan en wordt de lichaamsvreemde cel gefagocyteerd.Het complement systeem wordt geactiveerd zodra er een lichaamsvreemde stof is gedetecteerd. Het complement systeem omvat verschillende plasma’s en membraaneiwitten die een taak hebben bij de verdediging tegen deze lichaamsvreemde stof.

MBL is een serum eiwit die het complement systeem kan activeren. In verschillende artikelen is bewezen dat de MBL route een grote regulator is van het complement systeem. Doordat MBL bindt aan de lichaamsvreemde stof met behulp van mannose wordt de MBL route geactiveerd en de lichaamsvreemde cel uiteindelijke gefagocyteerd. MBL lijkt op C1q, het eiwit dat aan de start staat van de klassieke route. 

Belangrijke factoren die het belang van onderzoek naar MBL stimuleren zijn:

  • Het is de meest voorkomende immuundeficiency
  • Het is een risicofactor in combinatie met autoimmuun afwijking
  • Heeft een verband met verhoogd risico of scepsis.

Veel pasgeborene of te vroeg geborene hebben veel kans op infecties. Uit verschillende artikelen blijkt dat een afwijking in de MBL route hier een grote oorzaak in speelt. Uit onderzoek blijkt dat 40% van de onderzochte pasgeborene een te laag MBL gehalte had.(Low mannose-binding lectin (MBL) levels in neonates with pneumonia and sepsis, Frakking et all, 2007). Lage concentraties MBL vlak na de geboorte wordt geassocieerd met een verhoogde kans op de ontwikkeling van pneumonia en bevestigde bloedvergiftiging door een bacterie door een verlaagde capaciteit van fagocytose of opsonisatie van het lichaamsvreemde molecuul.

Is het zinvol om alle pasgeborene te testen op afwijking in de MBL route? Of is het alleen van toepassing op prematuur geborene?

De invloed van de S100 eiwit familie op Alzheimer

De S100 eiwitten vertegenwoordigen de grootste subgroep binnen de Ca2+ bindende superfamilie. De naam is ontstaan na de ontdekking van S100 eiwitten in koeienhersenen.
In de mens zijn er 21 verschillende S100 eiwitten geidentificeerd. Veel van deze eiwitten tonen kenmerkende patronen in verschillende tissues en celtypes, wat de hoge mate van specificiteit aangeeft. Door de grote verscheidenheid speelt de S100 familie een rol in verschillende processen zoals celgroei, celcyclus controle, celdifferentiatie en de beweeglijkheid van de cel.

Alzheimer

Eén van de S100 eiwitten, de S100B komt voornamelijk voor in het centraal zenuwstelsel. Verschillende studies hebben uitgewezen dat S100B een rol speelt in het geheugen, de capaciteit om te leren en bij de processen die aanleiding geven tot het ontstaan van epilepsie.
In tegenstelling tot andere eiwitten van de S100 familie ligt het gen voor de S100B op chromosoom 21. S100B bezit 2 Ca2+-bindingsplaatsen die gekoppeld worden door een hinge regio. Het S100B eiwit heeft interactie met verschillende intracellulaire targets, zoals met elementen van het cytoskelet (bv intermediaire filamenten) en met tumor suppressor p53. Extracellulair S100B kan endotheel cellen stimuleren. De regulatie van het vasculair adhesie molecuul (VCAM-1) ontstaat na binding met de RAGE, en receptor van de immuunglobuline superfamilie. Deze verbinding van S100B met RAGE zou kunnen bijdrage aan de chronische ontsteking waargenomen bij Alzheimer.
In verschillende studies is een verhoogde concentratie S100B waargenomen in hersenvloeistof van Alzheimer patiënten. Het is dan ook verleidelijk om te speculeren dat de rol van S100B in Alzheimer tot stand is gekomen door de verbinding met RAGE. Wat is de invloed van RAGE in deze ziekte? Is het zinvol om de rol van RAGE te onderzoeken in deze en andere ziektebeelden?

References:

1. Natural and amyloid self-assembly of S100 proteins: structural basis of functional diversity; Günter Fritz, Hugo M. Botelho, Ludmilla A. Morozova-Roche and Cláudio M. Gomes.
2. The S100 family of EF-hand calcium-binding proteins: functions and pathology; Schafer, B.W. and Heizmann, C.W.;  Trends Biochem. Sci. 21 (4), 134-140 (1996)
3. Serum S 100 B: a marker of brain damage in traumatic brain injury with and without multiple trauma; Pelinka, L.E., Toegel, E., Mauritz, W. and Redl, H.;  Shock 19 (3), 195-200 (2003)