Prosthetic Joint Infections (PJI), nu serologisch te bepalen

Het vervangen van een gewricht is een hele operatie, vaak bedoeld om de mobiliteit te vergroten. Maar wat als er na de operatie een infectie ontstaat? Infecties die geassocieerd worden met een gewrichtsoperatie komen niet zo vaak voor, maar zorgen voor de meest verwoestende complicaties. Naast langdurige ziekenhuisopname, risico op complicaties als gevolg van extra chirurgische behandelingen en de mogelijkheid van een hernieuwde handicap.

BJI InoplexMet de komst van de nieuwe BJI Inoplex test kunnen infecties eerder worden opgepikt. Het is bedoeld als hulpmiddel bij de detectie van orthopedische infecties, naast de reeds bestaande methoden (zoals CRP of radiografie) die geen operatieve handeling vereisen. De test is een non-invasieve test op basis van de immuunrespons van patiënten, die verdacht worden orthopedische infecties te hebben en met pijnklachten terugkomen in de kliniek. Deze patiënten zijn veelal kandidaat voor revisie chirurgie. Een goede diagnose voorafgaande aan de operatie kan van groot belang zijn om een goed behandelingstraject te bepalen.

De BJI Inoplex test is een multiplex assay die bestaat uit een panel van 16 antigenen die zijn geïsoleerd uit de meest voorkomende pathogenen die orthopedische infecties kunnen veroorzaken. De antigenen zijn gekoppeld aan microscopische beads op basis van de Luminex Technologie, die reageren met IgG antistoffen in het serum van de patiënt.

Advertenties

Microsatellite Instability (MSI)

Darmkanker is een van de meest voorkomende ziektes in de westerse wereld. Ondanks verbeteringen in operatietechnieken en chemotherapie zijn de vooruitzichten niet significant verbeterd in de laatste jaren.

Ondanks verschillende onderzoeken naar dieetfactoren, is de meest voor de hand liggende oorzaak, erfelijkheid, weinig onderzocht. De kennis over erfelijke factoren van kanker is schaars. Dit terwijl de oorzaak van kanker vaker erfelijk is dan is gedacht.

Heredarity nonpolyposis colorectal carcinoma (HNPCC), ook wel Lynch syndroom, is een dominant autosomaal syndroom wat verantwoordelijk is voor 5-10% van alle darmkanker lasten. Het gebrek aan diagnostische karakteristieken heeft gezorgd voor de introductie van bepaalde criteria om een diagnose te kunnen stellen. Deze criteria, Amsterdam criteria I, werden vastgesteld om HNPCC te diagnosticeren.

Er zijn veel onderzoeken gedaan naar de erfelijke factoren van HNPCC waaruit blijkt

PMS2 in colon cancer

PMS2 in colon cancer

dat microsatellite instability (MSI) in sommige gevallen gelinkt kan worden. Eind ’93 werd het verantwoordelijke gen, MSH2, gekloneerd en de mutaties in Lynch syndroom geïdentificeerd. Een tweede gen werd geïdentificeerd in ’94 welke ook werd gelinkt aan Lynch syndroom, MLH1. In de jaren hierna werden ook PMS2 en MSH6 geïdentificeerd als mutaties met Lynch syndroom als gevolg.

DNA replicatie wordt geassocieerd met een eindige error rate, inclusief de incorporatie van  mismatch van baseparen, en het verkeerd aflezen van DNA strengen tijdens duplicatie. Het niet kunnen repareren van deze mismatch resulteert in mutaties. Het DNA MisMatch Repair (MMR) systeem herkent deze fouten tijdens DNA polymerase. Een link tussen MSI en gebrekkige MMR was herkend.

Resultaten van MMR IHC testen vergeleken met MSI testen komen grotendeels overeen. Tijdens een grote studie werd voor het gecombineerd gebruik van MLH1 en MSH2 in IHC een gevoeligheid van 92.3%, en specificiteit van 100% gemeten voor de identificatie van tumoren. De toevoeging van MSH6 en PMS2 aan het IHC panel zou de gevoeligheid moeten verhogen aangezien MSH6 en PMS2 mutaties steeds meer herkend worden als oorzaak van het Lynch syndroom.

Niet alleen het Lynch syndroom maar ook andere kankersoorten kunnen worden herkend met het zogenaamde MSI panel. Dit panel bevat de PMS2, MSH6, MSH2 en de MLH1. Het gebruik van dit panel zou kunnen meewerken aan het onderzoek naar de invloed van erfelijke factoren.

Wat is Next Generation Sequencing?

Tijdens DNA sequencen wordt de volgorde bepaald van de nucleotides – adenine, guanine, cytosine en thymine –  van het DNA. De kennis en volgorde van het DNA is van onschatbare waarde voor biologische research, maar ook andere branches die gebruik maken van de DNA sequence zoals de diagnostiek, biotechnologie en forensisch onderzoek. De voordelen van DNA sequencing hebben de ontwikkelingen in de biotechnologie in een stroom versnelling geplaatst. De snelheid van sequencing die bereikt wordt met de moderne technieken zijn onder andere belangrijk geweest in het in kaart brengen van het humaan DNA tijdens het “Human Genome Project”.

Maar hoe werkt het DNA sequencing nu eigenlijk?

Het sequencen van DNA wordt al langere tijd gedaan. In de eerste methode, de Sanger methode, werd een PCR reactie gedaan, met in deze reactie een grote hoeveelheid ddNTPs. Tijdens deze PCR werd ieder base paar met een andere kleur geconjugeerd. Hierna werd de kleur en de lengte van de DNA fragementen bepaald, hiermee werd de sequence bepaald; een stuk DNA met een lengte 35 baseparen eindigend met een blauwe ddNTP wat aangaf dat er op de 35ste positie een C zat.
Het probleem met deze methode was dat het er veel ruimte nodig was. een plek om de PCR uit te voeren en dan cappilaire geltubes of een gewone gel om de lengte van het DNA te bepalen. Gevolg, er kunnen hooguit een paar honderd reacties tegelijkertijd gedaan worden. Er zijn 3 billioen baseparen in het humaan DNA, kortom het kost veel tijd mankracht om op deze manier het humaan DNA in kaarte brengen.

Met de komst van NGS heeft deze problemen overwonnen. Door het gebruik van een van de verschillende platformen kan er nu redelijk snel DNA in kaart gebracht worden. Bij de verschillende platformen plaats je het stuk DNA wat bekeken wordt in een well, dit wordt een cluster genoemd. Daar wordt het sequencen gedaan met als gevolg dat er veel verschillende clusters tegelijkertijd gesequenced kunnen worden. Hierdoor wordt de tijd om een gedeelte van het DNA in kaart te brengen verminderd.

NGS heeft de toekomst, en blijft zich ontwikkelen. Blijf op de hoogte van de laatste ontwikkelingen van NGS, neem contact met ons op en schrijf je in voor onze nieuwsbrief of vraag om een persoonlijke update.

Hoe werkt NGS?

Genoom DNA fragmenten kunnen worden omgezet naar een DNA library die klaar zijn voor het sequencen in de volgende stappen.  Van het gefragmenteerde DNA wordt eerst door middel van een zogenaamd “end repair” de uiteindes blunt end gemaakt (zie onderstaande afbeelding). Vervolgens wordt er een adenine base gekoppeld aan het DNA om zo een A-overhang te creëren. Nu kunnen de barcodes geligeerd worden omdat deze een T-overhang als uiteinde hebben. Na opzuiveren van het DNA worden de geselecteerde fragmenten met behulp van PCR geamplificeerd. Het DNA is nu klaar om te sequencen.

Barcodes

Barcodes bevatten geïndexeerde sequenties. Door verschillende barcodes te gebruiken kunnen er meerdere, verschillende gefragmenteerde stukjes DNA tegelijkertijd gesequenced worden. Met de huidige mogelijkheden van 96 barcodes worden er een veelvoud aan  libraries gemaakt. Het gebruik van de barcodes heeft als gevolg dat er meerdere samples tegelijkertijd  in één laan te sequencen zijn. Hierdoor is het uitvoeren van grotere sequentie projecten sneller, goedkoper en efficiënter geworden.

Bron: Basics: Sequencing DNA

Op zoek naar een microtiter plaat, maar wat is nu de beste?

De 96-wells plaat is misschien wel de meest gebruikte plaat die gebruikt wordt in de laboratoria. De plaat is verkrijgbaar in losse strips, afbreekbare strips, platte en ronde bodems. Tevens heeft de coating van de de plaat ook invloed op de resultaten van de assay. Welke plaat er ook gekozen wordt, er zijn verschillende keuzes die nu gemaakt moeten worden om de juiste coating te kiezen om het target te binden.

Plaat coating

Om het target te binden is het van belang om de juiste coating op de plaat te gebruiken. Een passieve coating heeft een brede range aan mogelijkheden omdat deze verschillende biomoleculen kan binden, gebaseerd op verschillende zwakke molecuul interacties. Deze verschillende interacties vormen samen een sterke binding aan het biomolecuul. Passieve coating is daarom primair bruikbaar voor middelgrote tot grote biomoleculen, zoals antilichamen. De exacte hoeveel moleculaire bindingsplaatsen is afhankelijk van het te binden biomolecuul, en de interactie met de coating. Bij een grote verscheidenheid aan biomoleculen wordt gebruik gemaakt van de passieve binding om het biomolecuul stabiel te binden.

De passieve coating is onder te verdelen in 4 verschillende subgroepen op basis van hydrofibiciteit; Hydrofoob, licht hydrofofiel, hydrifiel en sterk hydrofiel.

Hydrofoob
De hydrofobe coating wordt gebruikt voor de binden van biomoleculen rijk aan lipides.

Weinig hydrofiel
De licht hydrofiele coating vergroot de range aan biomoleculen die gebonden kunnen worden, inclusief glyco-eiwitten en lipopolysaccharides in serum, of serum samples. Met deze coating wordt de a-specifieke binding geminimaliseerd om de signal-to-noise (S/N) ratio te verhogen en hierdoor de gevoeligheid te vergroten.

Hydrofiel
De hydrofiele coating is geoptimaliseerd om grote hoeveelheden IgG te binden, wat deze platen uiterst geschikt maakt voor het gebruik in antilichaam sandwich assay’s, bijvoorbeeld ELISA. Verder heeft deze coating de mogelijkheid om een grote variëteit aan biomoleculen te binden die hydrofiele/hydrofobe karakteristieken hebben.

Sterk hydrofiel
Deze coating bindt in water oplosbare eiwitten en glycanen, maar de binding is pH gevoelig.

Overzicht bindingscapaciteit Nunc platen (Bron; ThermoFisher).

           

 

 

 

 

 

Welke plaat is het beste geschikt voor uw experiment? Komt u er niet uit? Vraag een sample aan via tech@sanbio.nl.

Transfectie, welke mogelijkheden zijn er?

Transfectie is het proces van het overbrengen van één bepaalde nucleine sequentie in een eukaryote cel. Nucleine sequenties die vaak gebruikt worden zijn DNA, RNA en eiwitten. Welke methodes zijn verkrijgbaar voor de transfectie? Hier worden er een aantal beschreven.

Magnetofectie
Magnetofectie is één van de mogelijkheden. Deze methode bindt nucleïnezuren of andere vectoren met magnetische nanodeeltjes, welke bedekt zijn met kationische moleculen. De magnetische nanodeeltjes zijn gemaakt van ijzer oxide, wat volledig biologisch afbreekbaar is, gecoat met specifieke kationische gepatenteerde moleculen. Hun associatie met het gen (DNA, siRNA, ODN, virus, etc.) wordt bereikt door zout-geïnduceerde colloïdaal aggregatie en elektrostatische interactie van de vectoren.

De resulterende moleculaire complexen zijn vervolgens gericht op de cellen, ondersteund door een passende magnetisch veld. Membraan architectuur en structuur blijven intact in tegenstelling tot andere fysieke transfectie methoden die schade geven of electroshock, die een gat maken in de celmembranen. Bovendien zijn de magnetische nanobeads volledig biologisch afbreekbaar en niet giftig bij de aanbevolen doseringen en zelfs nog hoger. Op deze manier wordt de volledige toegepast vector geconcentreerd op de cellen. Dus 100% van de cellen komt in contact met een belangrijke vector dosis.

Lipofectie
Lipofectie is een methode om genetische materiaal in de cel te brengen gebruik makende van liposomen. Het lipofectamine vormt vesikels met de complexen waarvan de buitenzijde qua samenstelling gelijkaardig is met die van het celmembraan. Als gevolg hiervan zullen de vesikels samensmelten met het celmembraan en zijn inhoud in de cel loodsen.
 
Elektroporatie
Elektroporatie is een techniek die door het aanleggen van een extern elektrische veld een verhoging van de elektrische geleiding en de permeabiliteit van het celmembraan als gevolg heeft. Het is een methode om extracellulaire partikels in de cel te brengen. De elektroporatiecondities moeten zodanig gekozen worden dat na introductie van de extracellulaire partikels het celmembraan zich spontaan herstelt en dat de schade aan de cellen zoveel mogelijk beperkt blijft.
 
i-MICST
De i-MICST (Intergrated Magnetic Immuno-Cell Sorting and Transfection/Transduction) technologie biedt de mogelijkheid om cellen te isoleren en modificeren in één efficiënte en betrouwbaar systeem.

Cytokeratines, dé tool in cytopathologie en cytometrische testen.

Cytokeratines

Cytokeratines (CK) zijn keratine bevattende eiwitten in de intermediaire filamenten welke gevonden worden in het intracytoplasmatisch cytoskelet van epitheel cellen.
De term cytokeratines wordt gebruikt sinds de jaren ’70, toen de subunits van de keratine ontdekt werden in de cellen. In 2006 is een nieuwe systematische naamgeving (CK1 t/m CK20) vanwege de biochemische diversiteit van de verschillende keratines. CK1 heeft het hoogste molecuulgewicht en hoogste isoelectrisch punt, terwijl CK19 het laagste molecuulgewicht en isoelectrisch punt heeft. Ze zijn opgedeeld in type I en type II sub klasse. De type I zijn de cytokeratines, genummerd CK9 t/m CK20, met een lage pH. De type II, genummerd CK1 t/m CK8, zijn basisch to pH neutraal.

Deze slideshow heeft JavaScript nodig.

Celbiologie

In het cytoplasma, vormen de keratine filamenten een complex netwerk welke reikt van de celkern tot aan het celmembraan. Verschillende complementaire eiwitten spelen een rol in het ontstaan en de handhaving van dit complex. 
Deze verbinding tussen het celmembraan en de celkern levert belangrijke informatie over het cytoplasma en de cellulaire communicatie. Uit verschillende studies is gebleken dat de keratines een rol spelen in de celmitose, de differentiatie en het voortbewegen van de cel.
De intermediaire filamenten van de eukaryotische cytoskelet, van welke cytokeratines één van de drie bestandsdelen is, zijn geassocieerd met het ankyrine en spectrine complex welke zich net onder het celmembraan bevindt.

 Diagnostiek

Intermediaire filamenten komen voor in vrijwel iedere cel van het menselijk lichaam en zijn een wezenlijk onderdeel van het cytoskelet. De filamenten zijn specifiek voor een weefsel, waardoor ze met behulp van antilichaam gericht tegen het intermediaire filamenteiwit epithiale, mesenchymale, spier-, zenuw- en gliacellen van elkaar kunnen onderscheiden. Dit geldt niet alleen voor gezond weefsel maar ook voor kwaadaardig weefsel en metastasen daarvan.
Antilichamen gericht tegen intermediaire filamenten kunnen belangrijke bijdrage leveren aan de differentiële diagnostiek van tumoren bij de mensen doordat met immunohistochemie op vriescoupes van operatiepreparaten en in uitstrijkpreparaten van sputum, urine of met de dunne naald geaspireerd weefsel de intermediaire filamenten zichtbaar gemaakt kunnen worden.

Het Ph chromosoom, het genetisch defect bij chronische myeloide leukemie (CML)

Chronisch myeloide leukemie (CML) is een vorm van leukemie waarbij witte bloedcellen in overmaat worden geproduceerd. Bij de grote meerderheid wordt het Philadelphia chromosoom gevonden. Het Ph chromosoom is verantwoordelijk voor de codering van BCR-ABL1.

Na de ontdekking van CML, meer dan 150 jaar geleden is er weinig tot geen progressie gemaakt met betrekking tot de genezing. Bestraling zorgde alleen voor een betere levenskwaliteit. De genezingskansen werden groter met de behandeling met Hydroxyurea (HU), en daarna nog groter met allogene hematopoietische stamcel transplantatie.

Het begrijpen van de ziekte begon met de ontdekking van het Philadelphia (Ph) chromosoom. De aanwezigheid van de Ph chromosoom is het gevolg van een genetische translocatie van de chromosomen 9 en 22. De ontdekking van het Ph chromosoom betekende ook de ontdekking van de BCR/ABL1 eiwitten, wat heeft geleid tot nieuwe onderzoeken. Door componenten te ontwikkelen die de activiteit van de tyrokinase verminderen, en dus de ontwikkeling van de ziekte remmen, is er een grote stap gezet in de ontwikkeling van een medicijn.

Detectie methode
Recent is er een nieuwe methode op de markt gekomen om dit Ph chromosoom te detecteren. Bij deze methode wordt een qPCR gecombineerd met een ELISA waarbij gebruik gemaakt wordt van beads. Dit biedt mogelijkheid om meerdere samples tegelijkertijd te testen met een hoge gevoeligheid, de detectie limiet ligt op 1 leukemie cel per 100.000 normale cellen . Door het monitoren van de tyrosine kinase inhibitor (TKI) ontstaat er een goede indicatie over de progressie van de ziekte.