Herprogrammering van stamcellen

Wetenschappers zijn al jaren bezig met het combineren van volgroeide cellen met embryonale cellen, maar beginnen nu pas te begrijpen welke mechanismes hieraan deelnemen. Wie kent er niet het schaap Dolly?

Schaap Dolly

In 1996 werd schaap Dolly gegroeid uit een uiercel van een volwassen ooi, een vrouwtjesschaap. Hiervoor werden de gespecialiseerde uiercellen “aangezet” tot een nieuwe taak, het uitgroeien van een nieuw organisme. Dat was de belangrijkste ingreep in het genetisch materiaal van het aankomend schaap. Daarna werd het gekloond en de tot geslachtscel omgebouwde cel in een draagmoederschaap geplaatst. Dolly was het enige geslaagde experiment uit meer dan 300 pogingen.

Induced pluripotent stem cells (iPS)

Het her programmeren van cellen kreeg steeds meer aandacht en schoot omhoog nadat er in 2006 werd ontdekt dat gespecialiseerde volwassen muiscellen konden worden aangezet tot nieuwe taken door slechts 4 genen. Hiermee werden de zogenaamde “induced pluripotent stem (iPS) cells” ontdekt. De methode was simpel genoeg zodat bijna ieder lab dit kon doen. Hiermee groeide ook de hoop dat het mogelijk kon zijn dat pluripotente cellen beschadigde of kapotte cellen kon herstellen of vervangen. Uiteindelijk na vele jaren onderzoek blijkt het gebruik van pluripotente cellen succesvol te kunnen worden toegepast, nadat in 2014 retinale cellen gekweekt uit pluripotente stamcellen, gebruikt werden in een transplantatie in het oog van een vrouw met een oogziekte. Dit was de eerste keer in de geschiedenis dat geherprogrammeerde stamcellen hiervoor werden gebruikt.(bron).

Aan dit alles zit één nadeel, niemand weet op dit moment exact hoe het “ombouwen” van volgroeide cellen naar pluripotente cellen werkt. Één van de problemen is dat het proces voor het maken van de pluripotente cellen niet effectief en variabel is. Alleen een kleine fractie van de cellen wordt omgezet naar pluripotente cellen en zelfs deze kunnen verschillen op minieme, maar belangrijke vlakken. Om het geheim van het omzetten naar pluripotente cellen te ontrafelen is er een internationale werkgroep opgericht met hierin de meest vooraanstaande wetenschappers op het gebied van stamcel technologie, genaamd Project Grandiose.

Onstaan van F-cellen, bron stemformatics.org

Project Grandiose

De grootste ontdekking van dit project is de ontdekking van een nieuwe categorie pluripotente cellen, de F-klasse cellen. Deze cellen verschillen van de iPS cellen op een van de strengste testen van pluripotentie; wanneer ingebracht in Muis embryo’s helpen ze niet met het maken van nieuw weefsel.

Het her programmeren van volgroeide cellen naar iPS cellen heeft nog vele geheimen en onderzoek om haar geheimen te ontrafelen is in volle gang. Één ding is zeker:

The one thing that we know is that it’s not magic,

there is a mechanism

 

bron: The Blackbox of reprogramming, David Cyranoski

Advertenties

Groeifactoren voor stimulatie celgroei in research setting

Groeifactoren zijn van nature voorkomende substanties die de mogelijkheid hebben om celgroei stimuleren. De groeifactoren zijn belangrijk voor de regulatie van verschillende cellulaire processen, en fungeren als signaalmoleculen tussen cellen. Ze initiëren cellen om te differentiëren en verouderen. Er zijn veel verschillende groeifactoren bekend die allen een andere invloed hebben op de cellen.

Reproduceerbaarheid

Voor het gebruik van groeifactoren in celassays is reproduceerbaarheid van de resultaten van essentieel belang. Eén van de stoffen die invloed heeft op de reproduceerbaarheid is endotoxine.

Endotoxines (lipopolysaccharides, LPS) worden geproduceerd in bacteriën zoals E. coli, die de meest gebruikte bacterie is voor de productie van groeifactoren.

Verschillende studies hebben nu bewezen dat endotoxine contaminatie, die aanwezig zijn in de groeifactoren geproduceerd in E. coli (1 EU/µg of 0.1 ng/ml), de cellen kunnen beïnvloeden. Dit beïnvloedt de reproduceerbaarheid van de celcultuur, omdat kleine verschillen in de concentratie van deze endotoxines onvoorspelbare effecten hebben op celkweek. Het gebruik van endotoxine-vrije groeifactoren verhoogt de reproduceerbaarheid van celkweek experimenten.

  • Verbeterde reproduceerbaarheid verhoogt consistentie in stamcel experimenten
  • Bespaart tijd en kostbare cellen
  • Leidt tot vereenvoudigde transfer van stamcel kweekprotocol voor pre-klinische research naar klinische trials

Invloed van endotoxine op celkweek experimenten, ORFgenetics 2014

Uitgebreid onderzoek laat duidelijk zien wat de invloed van endotoxines, toegestaan tijdens de productie van groei factoren in E.coli, is op stamcel onderzoek.

Microsatellite Instability (MSI)

Darmkanker is een van de meest voorkomende ziektes in de westerse wereld. Ondanks verbeteringen in operatietechnieken en chemotherapie zijn de vooruitzichten niet significant verbeterd in de laatste jaren.

Ondanks verschillende onderzoeken naar dieetfactoren, is de meest voor de hand liggende oorzaak, erfelijkheid, weinig onderzocht. De kennis over erfelijke factoren van kanker is schaars. Dit terwijl de oorzaak van kanker vaker erfelijk is dan is gedacht.

Heredarity nonpolyposis colorectal carcinoma (HNPCC), ook wel Lynch syndroom, is een dominant autosomaal syndroom wat verantwoordelijk is voor 5-10% van alle darmkanker lasten. Het gebrek aan diagnostische karakteristieken heeft gezorgd voor de introductie van bepaalde criteria om een diagnose te kunnen stellen. Deze criteria, Amsterdam criteria I, werden vastgesteld om HNPCC te diagnosticeren.

Er zijn veel onderzoeken gedaan naar de erfelijke factoren van HNPCC waaruit blijkt

PMS2 in colon cancer

PMS2 in colon cancer

dat microsatellite instability (MSI) in sommige gevallen gelinkt kan worden. Eind ’93 werd het verantwoordelijke gen, MSH2, gekloneerd en de mutaties in Lynch syndroom geïdentificeerd. Een tweede gen werd geïdentificeerd in ’94 welke ook werd gelinkt aan Lynch syndroom, MLH1. In de jaren hierna werden ook PMS2 en MSH6 geïdentificeerd als mutaties met Lynch syndroom als gevolg.

DNA replicatie wordt geassocieerd met een eindige error rate, inclusief de incorporatie van  mismatch van baseparen, en het verkeerd aflezen van DNA strengen tijdens duplicatie. Het niet kunnen repareren van deze mismatch resulteert in mutaties. Het DNA MisMatch Repair (MMR) systeem herkent deze fouten tijdens DNA polymerase. Een link tussen MSI en gebrekkige MMR was herkend.

Resultaten van MMR IHC testen vergeleken met MSI testen komen grotendeels overeen. Tijdens een grote studie werd voor het gecombineerd gebruik van MLH1 en MSH2 in IHC een gevoeligheid van 92.3%, en specificiteit van 100% gemeten voor de identificatie van tumoren. De toevoeging van MSH6 en PMS2 aan het IHC panel zou de gevoeligheid moeten verhogen aangezien MSH6 en PMS2 mutaties steeds meer herkend worden als oorzaak van het Lynch syndroom.

Niet alleen het Lynch syndroom maar ook andere kankersoorten kunnen worden herkend met het zogenaamde MSI panel. Dit panel bevat de PMS2, MSH6, MSH2 en de MLH1. Het gebruik van dit panel zou kunnen meewerken aan het onderzoek naar de invloed van erfelijke factoren.

Transfectie en drug delivery

Tecrea is actief in het veld van de basale research. Ze richten zich op het creatief gebruik van nanotechnologie voor de opname van kleine en grote moleculen in de cel.  Doordat veel medicijnen niet door de celwand kunnen is dit één van de problemen in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Met de research naar het verbeteren van de doorgang van de celwand met het intact houden van de werking van de cel ondersteunt Tecrea onderzoek naar nieuwe moderne medicijnen.

Transfectie

Transfectie is het inbrengen van lichaamsvreemde stoffen in een cel met het behoud van de werking van de cel. Tecrea heeft hiervoor HappyFect™ ontwikkeld. HappyFect™ is een revolutionaire nieuw transfectie reagent die plasmides  en andere kleine lichaamsvreemde stoffen in een cel kan brengen zonder de cel te doden of te inactiveren. HappyFect™ kan gebruikt worden in verschillende zoogdiercellen, is niet toxisch en snel. Met behulp van HappyFect™ kan snel en effectief plasmides en siRNA worden ingebracht in de cel.

Drug delivery

Veel bruikbare medicijnen worden niet op de markt gebracht omdat ze niet of slecht de celwand door kunnen. De opname van het medicijn is de belangrijkste, maar moeilijkste punt in de ontwikkeling van een medicijn. Zelfs bestaande medicijnen zouden nog beter kunnen werken wanneer de opname door de cel beter is. Met NanoCargo™ kunnen grotere eiwitten en moleculen worden opgenomen door de cel.

Nanotechnolgie

Bij onderzoek naar onder andere medicijnen wordt steeds meer naar details gekeken. Waar microtechnologie de toekomst was zijn we nu vooral geinteresseerd in de nog kleinere details van de cel. Met behulp van nanotechnologie kan nog beter in kaart worden gebracht hoe de mechanismes in het lichaam werken.

Wat is Next Generation Sequencing?

Tijdens DNA sequencen wordt de volgorde bepaald van de nucleotides – adenine, guanine, cytosine en thymine –  van het DNA. De kennis en volgorde van het DNA is van onschatbare waarde voor biologische research, maar ook andere branches die gebruik maken van de DNA sequence zoals de diagnostiek, biotechnologie en forensisch onderzoek. De voordelen van DNA sequencing hebben de ontwikkelingen in de biotechnologie in een stroom versnelling geplaatst. De snelheid van sequencing die bereikt wordt met de moderne technieken zijn onder andere belangrijk geweest in het in kaart brengen van het humaan DNA tijdens het “Human Genome Project”.

Maar hoe werkt het DNA sequencing nu eigenlijk?

Het sequencen van DNA wordt al langere tijd gedaan. In de eerste methode, de Sanger methode, werd een PCR reactie gedaan, met in deze reactie een grote hoeveelheid ddNTPs. Tijdens deze PCR werd ieder base paar met een andere kleur geconjugeerd. Hierna werd de kleur en de lengte van de DNA fragementen bepaald, hiermee werd de sequence bepaald; een stuk DNA met een lengte 35 baseparen eindigend met een blauwe ddNTP wat aangaf dat er op de 35ste positie een C zat.
Het probleem met deze methode was dat het er veel ruimte nodig was. een plek om de PCR uit te voeren en dan cappilaire geltubes of een gewone gel om de lengte van het DNA te bepalen. Gevolg, er kunnen hooguit een paar honderd reacties tegelijkertijd gedaan worden. Er zijn 3 billioen baseparen in het humaan DNA, kortom het kost veel tijd mankracht om op deze manier het humaan DNA in kaarte brengen.

Met de komst van NGS heeft deze problemen overwonnen. Door het gebruik van een van de verschillende platformen kan er nu redelijk snel DNA in kaart gebracht worden. Bij de verschillende platformen plaats je het stuk DNA wat bekeken wordt in een well, dit wordt een cluster genoemd. Daar wordt het sequencen gedaan met als gevolg dat er veel verschillende clusters tegelijkertijd gesequenced kunnen worden. Hierdoor wordt de tijd om een gedeelte van het DNA in kaart te brengen verminderd.

NGS heeft de toekomst, en blijft zich ontwikkelen. Blijf op de hoogte van de laatste ontwikkelingen van NGS, neem contact met ons op en schrijf je in voor onze nieuwsbrief of vraag om een persoonlijke update.

Hoe werkt NGS?

Genoom DNA fragmenten kunnen worden omgezet naar een DNA library die klaar zijn voor het sequencen in de volgende stappen.  Van het gefragmenteerde DNA wordt eerst door middel van een zogenaamd “end repair” de uiteindes blunt end gemaakt (zie onderstaande afbeelding). Vervolgens wordt er een adenine base gekoppeld aan het DNA om zo een A-overhang te creëren. Nu kunnen de barcodes geligeerd worden omdat deze een T-overhang als uiteinde hebben. Na opzuiveren van het DNA worden de geselecteerde fragmenten met behulp van PCR geamplificeerd. Het DNA is nu klaar om te sequencen.

Barcodes

Barcodes bevatten geïndexeerde sequenties. Door verschillende barcodes te gebruiken kunnen er meerdere, verschillende gefragmenteerde stukjes DNA tegelijkertijd gesequenced worden. Met de huidige mogelijkheden van 96 barcodes worden er een veelvoud aan  libraries gemaakt. Het gebruik van de barcodes heeft als gevolg dat er meerdere samples tegelijkertijd  in één laan te sequencen zijn. Hierdoor is het uitvoeren van grotere sequentie projecten sneller, goedkoper en efficiënter geworden.

Bron: Basics: Sequencing DNA

Wat is het belang van de Inhibitor Removal Technology® (IRT) bij DNA isolaties?

Het gepatenteerde IRT® van MoBio geeft researchers de mogelijkheid om DNA te zuiveren uit elk sample, zelfs degene met een hoge concentratie PCR remmers zoals zuren, suikers en kleurstoffen.

Door gebruik te maken van deze gepatenteerde technologie kunnen de enzymatische PCR remmers geisoleerd worden uit alle samples, inclusief water, ontlasting, grond en planten om hoog gezuiverd DNA of RNA te verkrijgen. Dit kan snel en simpel gedaan worden met spin- of capture kollommen. Zelfs gearchiveerde, en op dat moment onbruikbare DNA samples kunnen gezuiverd worden.

Is er data beschikbaar over ge-extraheerde DNA samples met de IRT®?

Het antwoord hierop is JA! Tijdens de ontwikkeling van deze technologie is er een test gedaan met 2 water extractie kits van de leverancier, de PowerWater® en de RapidWater®. De PowerWater® bevat de IRT® technologie, verder zijn de kits identiek.
Vergelijkbare hoeveelheden DNA zijn ge-extraheerd (zie afbeelding), maar de Rt-PCR laat zien dat de IRT® technologie voor zuiverder DNA zorgt.

De IRT technologie wordt gebruikt in de verschillende producten van MoBio, zoals:
Powersoil®, PowerMax®, PowerPlant® en vele andere.

Samples zijn gratis te verkrijgen, vraag uw sample aan via tech@sanbio.nl.

MBL, een deel van het afweersysteem

Het mensenlijk lichaam wordt dagelijks aangevallen door 10-duizenden lichaamsvreemde moleculen, deze worden door ons immuunsysteem verwijderd zonder dat we er iets van merken. Ons immuunsysteem is opgebouwd uit een groot aantal cellen en moleculen. Deze werken door interactie in lymfoïde organen samen aan het afweren van lichaamsvreemde moleculen. Het immuunsysteem is opgebouwd uit een aangeboren, niet specifiek systeem, en een aangeleerd, specifiek systeem. Het aangeboren systeem is de “first line of defence”. Het aangeleerde systeem heeft geheugen cellen, deze cellen herkennen een lichaamsvreemd molecuul en kunnen meteen de juiste antilichamen laten produceren om het molecuul te verwijderen.

Het aangeboren systeem bestaat uit verschillende cellen in ons bloed, zoals granulocyten, monocyten, macrofagen, dendritische cellen en Natural-Killer cellen (NKcellen). Deze hebben ieder zijn eigen taak in het niet-specifieke systeem.
Naast deze cellulaire factoren zijn er ook humorale factoren die een invloed hebben op dit systeem. Deze factoren worden het complement systeem genoemd.

Afb 1: Complement system, provided by Hycult Biotech, Uden

 In dit complement systeem zijn 3 verschillende routes, de klassieke route, de alternatieve route en de Manose Binding Lectin (MBL) route. Al deze verschillende routes activeren het complement systeem wat als doel heeft het lichaamsvreemde molecuul  te fagocyteren.

Naast het aangeboren, niet specifieke systeem is het immuunsysteem ook opgebouwd uit het aangeleerde, specifieke systeem. In dit systeem zijn T-cellen de belangrijkste cellen, deze zorgen voor de cellulaire immuniteit. De B-cellen zorgen voor de humorale immuniteit. Dit systeem is in het bezit van memory cellen, die bij herkenning van het lichaamsvreemde molecuul meteen het juiste antilichaam kunnen laten produceren. Hierdoor wordt het lichaamsvreemde molecuul snel verwijderd. Doordat er veel verschillende lichaamsvreemde moleculen ons lichaam aanvallen zijn er ook veel verschillende memory cellen.

Figure 2: Membrane Attack Complex (MAC)

In het klassieke systeem bindt het C1-complex aan de lichaamsvreemde stof (zie afbeelding 1). Na activatie van het complement systeem volgt er een cascade met moleculen die binden aan het lichaamsvreemde molecuul met als uiteindelijk resultaat de vorming van het MAC (Membrane Attack Complex, Afb 2). Hierdoor ontstaan er gaten in het celmembraan en wordt de lichaamsvreemde cel gefagocyteerd.Het complement systeem wordt geactiveerd zodra er een lichaamsvreemde stof is gedetecteerd. Het complement systeem omvat verschillende plasma’s en membraaneiwitten die een taak hebben bij de verdediging tegen deze lichaamsvreemde stof.

MBL is een serum eiwit die het complement systeem kan activeren. In verschillende artikelen is bewezen dat de MBL route een grote regulator is van het complement systeem. Doordat MBL bindt aan de lichaamsvreemde stof met behulp van mannose wordt de MBL route geactiveerd en de lichaamsvreemde cel uiteindelijke gefagocyteerd. MBL lijkt op C1q, het eiwit dat aan de start staat van de klassieke route. 

Belangrijke factoren die het belang van onderzoek naar MBL stimuleren zijn:

  • Het is de meest voorkomende immuundeficiency
  • Het is een risicofactor in combinatie met autoimmuun afwijking
  • Heeft een verband met verhoogd risico of scepsis.

Veel pasgeborene of te vroeg geborene hebben veel kans op infecties. Uit verschillende artikelen blijkt dat een afwijking in de MBL route hier een grote oorzaak in speelt. Uit onderzoek blijkt dat 40% van de onderzochte pasgeborene een te laag MBL gehalte had.(Low mannose-binding lectin (MBL) levels in neonates with pneumonia and sepsis, Frakking et all, 2007). Lage concentraties MBL vlak na de geboorte wordt geassocieerd met een verhoogde kans op de ontwikkeling van pneumonia en bevestigde bloedvergiftiging door een bacterie door een verlaagde capaciteit van fagocytose of opsonisatie van het lichaamsvreemde molecuul.

Is het zinvol om alle pasgeborene te testen op afwijking in de MBL route? Of is het alleen van toepassing op prematuur geborene?