Join the resolution!

Het uitvoeren van de Southern blot is een lange en arbeidsintensieve bepaling waar veel valkuilen in zitten. Met de nieuwe mogelijkheden op het gebied van moleculaire testen is het nu mogelijk om deze methode over te slaan voor het bepalen van afwijkingen in het Fragiele X gen.

Fragiele X gen

Het fragiele-X-syndroom is een erfelijke aandoening welke gepaard gaat met een verstandelijk handicap. Het wordt veroorzaakt in een mutatie in het FMR1 gen. Dit FMR1 gen bevat meer dan 200 CGG repeats (herhalingen). Een mutatie in dit gen veroorzaakt het fragiele-X-syndroom. Deze mutatie zet zich eindeloos voort en wanneer dit meer dan 200 herhaling heeft kan het gen niet meer normaal functioneren.

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Detectie

Sinds ’91 wordt het de status van het gen bepaald met behulp van de Southern Blot. Maar zoals eerder beschreven is dit een arbeidsintensieve behandeling, die ook een grote hoeveelheden DNA nodig heeft, slechte gevoeligheid en resolutie heeft vergeleken met de nieuwe PCR methode. Methodes om de gemethyleerde status van het gen te bepalen zonder Southern Blot zijn gebaseerd op chemische of enzymatische voorbehandelingsmethodes van het DNA voor PCR.

Chemische voorbehandeling vereist Natrium BiSulfite om het gemethyleerde Cytosine om te zetten naar Uracil. Deze omzetting kan gemeten worden verschillende technieken inclusief DNA sequencing, PCR en melting curve analyse. Deze methodes zijn meer bruikbaar voor het diagnosticeren van mannelijk DNA omdat de aanwezigheid van 2 X-chromosomen in vrouwelijk DNA de bepaling kan verstoren.

Enzymatische voorbehandeling

De enzymatische voorbehandeling maakt gebruik van methyl gevoelige restrictie enzymen die het ongemethyleerde DNA verteren. Meerdere technieken kunnen hierna gebruikt worden om de gemethyleerde status van het gen te bepalen door het vergelijken van de amplicons van verteerde en onverteerde DNA. Voorbeelden hiervan zijn PCR, het werken met probes of capillaire electroforese.

Recente methodes hebben laten zien dat de enzymatische voorbehandeling in combinatie met complete amplificatie van het FMR1 CGG herhalingen een nauwkeurig beeld geven van zowel mannelijk als vrouwelijk DNA.

bron: www.nomoresouthernblots.com

Advertenties

Wat is Next Generation Sequencing?

Tijdens DNA sequencen wordt de volgorde bepaald van de nucleotides – adenine, guanine, cytosine en thymine –  van het DNA. De kennis en volgorde van het DNA is van onschatbare waarde voor biologische research, maar ook andere branches die gebruik maken van de DNA sequence zoals de diagnostiek, biotechnologie en forensisch onderzoek. De voordelen van DNA sequencing hebben de ontwikkelingen in de biotechnologie in een stroom versnelling geplaatst. De snelheid van sequencing die bereikt wordt met de moderne technieken zijn onder andere belangrijk geweest in het in kaart brengen van het humaan DNA tijdens het “Human Genome Project”.

Maar hoe werkt het DNA sequencing nu eigenlijk?

Het sequencen van DNA wordt al langere tijd gedaan. In de eerste methode, de Sanger methode, werd een PCR reactie gedaan, met in deze reactie een grote hoeveelheid ddNTPs. Tijdens deze PCR werd ieder base paar met een andere kleur geconjugeerd. Hierna werd de kleur en de lengte van de DNA fragementen bepaald, hiermee werd de sequence bepaald; een stuk DNA met een lengte 35 baseparen eindigend met een blauwe ddNTP wat aangaf dat er op de 35ste positie een C zat.
Het probleem met deze methode was dat het er veel ruimte nodig was. een plek om de PCR uit te voeren en dan cappilaire geltubes of een gewone gel om de lengte van het DNA te bepalen. Gevolg, er kunnen hooguit een paar honderd reacties tegelijkertijd gedaan worden. Er zijn 3 billioen baseparen in het humaan DNA, kortom het kost veel tijd mankracht om op deze manier het humaan DNA in kaarte brengen.

Met de komst van NGS heeft deze problemen overwonnen. Door het gebruik van een van de verschillende platformen kan er nu redelijk snel DNA in kaart gebracht worden. Bij de verschillende platformen plaats je het stuk DNA wat bekeken wordt in een well, dit wordt een cluster genoemd. Daar wordt het sequencen gedaan met als gevolg dat er veel verschillende clusters tegelijkertijd gesequenced kunnen worden. Hierdoor wordt de tijd om een gedeelte van het DNA in kaart te brengen verminderd.

NGS heeft de toekomst, en blijft zich ontwikkelen. Blijf op de hoogte van de laatste ontwikkelingen van NGS, neem contact met ons op en schrijf je in voor onze nieuwsbrief of vraag om een persoonlijke update.

Hoe werkt NGS?

Genoom DNA fragmenten kunnen worden omgezet naar een DNA library die klaar zijn voor het sequencen in de volgende stappen.  Van het gefragmenteerde DNA wordt eerst door middel van een zogenaamd “end repair” de uiteindes blunt end gemaakt (zie onderstaande afbeelding). Vervolgens wordt er een adenine base gekoppeld aan het DNA om zo een A-overhang te creëren. Nu kunnen de barcodes geligeerd worden omdat deze een T-overhang als uiteinde hebben. Na opzuiveren van het DNA worden de geselecteerde fragmenten met behulp van PCR geamplificeerd. Het DNA is nu klaar om te sequencen.

Barcodes

Barcodes bevatten geïndexeerde sequenties. Door verschillende barcodes te gebruiken kunnen er meerdere, verschillende gefragmenteerde stukjes DNA tegelijkertijd gesequenced worden. Met de huidige mogelijkheden van 96 barcodes worden er een veelvoud aan  libraries gemaakt. Het gebruik van de barcodes heeft als gevolg dat er meerdere samples tegelijkertijd  in één laan te sequencen zijn. Hierdoor is het uitvoeren van grotere sequentie projecten sneller, goedkoper en efficiënter geworden.

Bron: Basics: Sequencing DNA

Wat is het belang van de Inhibitor Removal Technology® (IRT) bij DNA isolaties?

Het gepatenteerde IRT® van MoBio geeft researchers de mogelijkheid om DNA te zuiveren uit elk sample, zelfs degene met een hoge concentratie PCR remmers zoals zuren, suikers en kleurstoffen.

Door gebruik te maken van deze gepatenteerde technologie kunnen de enzymatische PCR remmers geisoleerd worden uit alle samples, inclusief water, ontlasting, grond en planten om hoog gezuiverd DNA of RNA te verkrijgen. Dit kan snel en simpel gedaan worden met spin- of capture kollommen. Zelfs gearchiveerde, en op dat moment onbruikbare DNA samples kunnen gezuiverd worden.

Is er data beschikbaar over ge-extraheerde DNA samples met de IRT®?

Het antwoord hierop is JA! Tijdens de ontwikkeling van deze technologie is er een test gedaan met 2 water extractie kits van de leverancier, de PowerWater® en de RapidWater®. De PowerWater® bevat de IRT® technologie, verder zijn de kits identiek.
Vergelijkbare hoeveelheden DNA zijn ge-extraheerd (zie afbeelding), maar de Rt-PCR laat zien dat de IRT® technologie voor zuiverder DNA zorgt.

De IRT technologie wordt gebruikt in de verschillende producten van MoBio, zoals:
Powersoil®, PowerMax®, PowerPlant® en vele andere.

Samples zijn gratis te verkrijgen, vraag uw sample aan via tech@sanbio.nl.

Op zoek naar een microtiter plaat, maar wat is nu de beste?

De 96-wells plaat is misschien wel de meest gebruikte plaat die gebruikt wordt in de laboratoria. De plaat is verkrijgbaar in losse strips, afbreekbare strips, platte en ronde bodems. Tevens heeft de coating van de de plaat ook invloed op de resultaten van de assay. Welke plaat er ook gekozen wordt, er zijn verschillende keuzes die nu gemaakt moeten worden om de juiste coating te kiezen om het target te binden.

Plaat coating

Om het target te binden is het van belang om de juiste coating op de plaat te gebruiken. Een passieve coating heeft een brede range aan mogelijkheden omdat deze verschillende biomoleculen kan binden, gebaseerd op verschillende zwakke molecuul interacties. Deze verschillende interacties vormen samen een sterke binding aan het biomolecuul. Passieve coating is daarom primair bruikbaar voor middelgrote tot grote biomoleculen, zoals antilichamen. De exacte hoeveel moleculaire bindingsplaatsen is afhankelijk van het te binden biomolecuul, en de interactie met de coating. Bij een grote verscheidenheid aan biomoleculen wordt gebruik gemaakt van de passieve binding om het biomolecuul stabiel te binden.

De passieve coating is onder te verdelen in 4 verschillende subgroepen op basis van hydrofibiciteit; Hydrofoob, licht hydrofofiel, hydrifiel en sterk hydrofiel.

Hydrofoob
De hydrofobe coating wordt gebruikt voor de binden van biomoleculen rijk aan lipides.

Weinig hydrofiel
De licht hydrofiele coating vergroot de range aan biomoleculen die gebonden kunnen worden, inclusief glyco-eiwitten en lipopolysaccharides in serum, of serum samples. Met deze coating wordt de a-specifieke binding geminimaliseerd om de signal-to-noise (S/N) ratio te verhogen en hierdoor de gevoeligheid te vergroten.

Hydrofiel
De hydrofiele coating is geoptimaliseerd om grote hoeveelheden IgG te binden, wat deze platen uiterst geschikt maakt voor het gebruik in antilichaam sandwich assay’s, bijvoorbeeld ELISA. Verder heeft deze coating de mogelijkheid om een grote variëteit aan biomoleculen te binden die hydrofiele/hydrofobe karakteristieken hebben.

Sterk hydrofiel
Deze coating bindt in water oplosbare eiwitten en glycanen, maar de binding is pH gevoelig.

Overzicht bindingscapaciteit Nunc platen (Bron; ThermoFisher).

           

 

 

 

 

 

Welke plaat is het beste geschikt voor uw experiment? Komt u er niet uit? Vraag een sample aan via tech@sanbio.nl.

ImmunoFluorescentie Assay, een goede manier om tissue te kleuren

Immunofluorescentie (IFA) is een techniek waarmee het verkregen weefsel direct wordt gekleurd en bekeken kan worden met behulp van een fluorescentie microscoop. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die fluorescent gelabeld zijn, en binden aan het biologische antigeen in het celweefsel. IFA wordt veel gebruikt in de immunohistochemie. IFA kan gebruikt worden op celweefsel, gekweekte cellijnen en individuele cellen.

Methodes

Binnen de IFA bestaan er twee methodes; de directe en de indirecte techniek. Tijdens de directe methode wordt het gelabelde antilichaam direct gekoppeld aan het target in de cel, dat het mogelijk maakt om deze uit te lezen met de fluorescentie microscoop. Voordelen van deze methode zijn de korte stappen, snelle procedure, minder last van kruisreactiviteit en hoge mate van specificiteit. Nadeel is de mindere gevoeligheid doordat er minder antilichamen gebonden kunnen worden aan het antigeen dan met de indirecte methode.

Tijdens de indirecte methode wordt wordt eerst een primair antilichaam gekoppeld aan het antigeen waarna er een fluorescent gelabeld secundair antilichaam gekoppeld kan worden aan het primaire antilichaam. Deze methode is gevoeliger omdat er meerdere secundaire antilichamen gekoppeld kunnen worden aan het primaire antilichaam, maar deze methode is complexer en kost meer tijd.

Aan deze techniek zitten wat beperkingen. Verlies in activiteit kan veroorzaakt worden door het blootstellen van de gelabelde cellen aan licht. Dit kan beïnvloed worden door de cellen een kortere tijd bloot te stellen aan licht, een verhoogde concentratie conjugaat te gebruiken of labels te gebruiken die beter bestand zijn tegen licht (bijvoorbeeld Dylight, Alexa Fluors). Immunofluorencentie werkt alleen op gefixeerde, dode cellen omdat antilichamen niet door het celmembraan kunnen.

Zeus Hep 2 guide

MBL, een deel van het afweersysteem

Het mensenlijk lichaam wordt dagelijks aangevallen door 10-duizenden lichaamsvreemde moleculen, deze worden door ons immuunsysteem verwijderd zonder dat we er iets van merken. Ons immuunsysteem is opgebouwd uit een groot aantal cellen en moleculen. Deze werken door interactie in lymfoïde organen samen aan het afweren van lichaamsvreemde moleculen. Het immuunsysteem is opgebouwd uit een aangeboren, niet specifiek systeem, en een aangeleerd, specifiek systeem. Het aangeboren systeem is de “first line of defence”. Het aangeleerde systeem heeft geheugen cellen, deze cellen herkennen een lichaamsvreemd molecuul en kunnen meteen de juiste antilichamen laten produceren om het molecuul te verwijderen.

Het aangeboren systeem bestaat uit verschillende cellen in ons bloed, zoals granulocyten, monocyten, macrofagen, dendritische cellen en Natural-Killer cellen (NKcellen). Deze hebben ieder zijn eigen taak in het niet-specifieke systeem.
Naast deze cellulaire factoren zijn er ook humorale factoren die een invloed hebben op dit systeem. Deze factoren worden het complement systeem genoemd.

Afb 1: Complement system, provided by Hycult Biotech, Uden

 In dit complement systeem zijn 3 verschillende routes, de klassieke route, de alternatieve route en de Manose Binding Lectin (MBL) route. Al deze verschillende routes activeren het complement systeem wat als doel heeft het lichaamsvreemde molecuul  te fagocyteren.

Naast het aangeboren, niet specifieke systeem is het immuunsysteem ook opgebouwd uit het aangeleerde, specifieke systeem. In dit systeem zijn T-cellen de belangrijkste cellen, deze zorgen voor de cellulaire immuniteit. De B-cellen zorgen voor de humorale immuniteit. Dit systeem is in het bezit van memory cellen, die bij herkenning van het lichaamsvreemde molecuul meteen het juiste antilichaam kunnen laten produceren. Hierdoor wordt het lichaamsvreemde molecuul snel verwijderd. Doordat er veel verschillende lichaamsvreemde moleculen ons lichaam aanvallen zijn er ook veel verschillende memory cellen.

Figure 2: Membrane Attack Complex (MAC)

In het klassieke systeem bindt het C1-complex aan de lichaamsvreemde stof (zie afbeelding 1). Na activatie van het complement systeem volgt er een cascade met moleculen die binden aan het lichaamsvreemde molecuul met als uiteindelijk resultaat de vorming van het MAC (Membrane Attack Complex, Afb 2). Hierdoor ontstaan er gaten in het celmembraan en wordt de lichaamsvreemde cel gefagocyteerd.Het complement systeem wordt geactiveerd zodra er een lichaamsvreemde stof is gedetecteerd. Het complement systeem omvat verschillende plasma’s en membraaneiwitten die een taak hebben bij de verdediging tegen deze lichaamsvreemde stof.

MBL is een serum eiwit die het complement systeem kan activeren. In verschillende artikelen is bewezen dat de MBL route een grote regulator is van het complement systeem. Doordat MBL bindt aan de lichaamsvreemde stof met behulp van mannose wordt de MBL route geactiveerd en de lichaamsvreemde cel uiteindelijke gefagocyteerd. MBL lijkt op C1q, het eiwit dat aan de start staat van de klassieke route. 

Belangrijke factoren die het belang van onderzoek naar MBL stimuleren zijn:

  • Het is de meest voorkomende immuundeficiency
  • Het is een risicofactor in combinatie met autoimmuun afwijking
  • Heeft een verband met verhoogd risico of scepsis.

Veel pasgeborene of te vroeg geborene hebben veel kans op infecties. Uit verschillende artikelen blijkt dat een afwijking in de MBL route hier een grote oorzaak in speelt. Uit onderzoek blijkt dat 40% van de onderzochte pasgeborene een te laag MBL gehalte had.(Low mannose-binding lectin (MBL) levels in neonates with pneumonia and sepsis, Frakking et all, 2007). Lage concentraties MBL vlak na de geboorte wordt geassocieerd met een verhoogde kans op de ontwikkeling van pneumonia en bevestigde bloedvergiftiging door een bacterie door een verlaagde capaciteit van fagocytose of opsonisatie van het lichaamsvreemde molecuul.

Is het zinvol om alle pasgeborene te testen op afwijking in de MBL route? Of is het alleen van toepassing op prematuur geborene?

Hepatitis E, onderschatte ziekte nr 1?

Hepatitis E (HEV) wordt gezien als backpakkers disease, maar klopt dit wel? HEV wordt steeds vaker als diagnose gesteld bij mensen die helemaal niet reizen of in landen geweest zijn waar deze ziekte heerst. Wat zijn de gevolgen hiervan? Hoe wordt het virus verspreid?
Dat HEV geen onschuldig virus is blijkt uit de literatuur. De combinatie van HEV en chronische leveronsteking heeft een slechte prognose. Er wordt vaak de verkeerde diagnose gesteld; Drug-induced liver injury. (1); Hepatitis E; an emerging infection in developed countries. Klinisch is HEV niet te onderscheiden van Hepatitis A, maar Hepatitis A komt minder voor.

Inleiding

HEV is een acute leverontsteking op basis van een besmetting met het Hepatitis E-virus. HEV is een RNA virus onderverdeeld in 4 verschillende genotypes. Genotypes 1 & 2 zijn alleen vastgesteld in mensen, genotypes 3 & 4 zijn naast mensen ook vastgesteld in verschillende zoogdieren zoals varkens, kippen, herten. Genotype 3 wordt vaak als diagnose gesteld bij mensen in de westerse wereld. HEV is een ziekte die zich alleen in mensen uit, maar mede wordt overgedragen door dieren. Het varken is hierbij de grootste bron. Meer dan 50% van de in 2005 onderzochte Nederlandse varkensboerderijen zijn besmet (Hepatitis E virus risk profile, Rutjes et al; 2005), waarbij het HEV is gemeten in de faeces van de dieren.
HEV is vaak voorkomend in de gehele tropische en subtropische zone, waarbij India en Noord-Afrika bekend staan als haarden van HEV. Genotype 2 wordt hier vaak bevestigd (2) (Hepatitis E in Nederland, Zaaijer 2007) HEV kan asymptotisch voorkomen, waardoor de mens wel dragend kan zijn, maar niet ziek.
Er wordt verondersteld dat de ziekte op verschillende manieren kan worden overgedragen maar er zijn er nog niet zoveel bevestigd.  De bevestigde routes van infectie zijn bloedtransfusie, het eten van niet goed gekookt vlees van varkens en wild.
De faeces van varkens en wild komen uiteindelijk in het water terecht. Zou de infectie ook kunnen worden opgelopen door het drinken van kraanwater, het eten van groentes die besproeid zijn of door recreatie in zeeën of rivieren?
De incubatie periode voor HEV is van 2 tot 9 weken, en heeft verschillende symptomen zoals geelzucht, koorts, braken en gewichtsverlies.

Is het wel zo’n groot probleem?

In het onderzoek naar HEV is nog veel onbekend? HEV is sporadisch vast gesteld in de westerse landen, maar is dit het gevolg van het ontbreken van een goede detectie methode? Of weet men niet waar, of hoe, er gezocht moet worden? HEV wordt over de hele wereld gedetecteerd, met de gevalideerde methodes of met home-made testen. Welke resultaten zijn betrouwbaar?
Uit vergelijk tussen de verschillende commercieel verkrijgbare testen komen grote verschillen voor in gevoeligheid, en betrouwbaarheid van de resultaten. In de vergelijkings studie tussen de anti-HEV kits van Wantai en Genelab blijkt de kit van Wantai gevoeliger te zijn (0.25 vs 2.5 WHO units/mL) en meer sera als positief te bestempelen van HEV bevestigde casussen (98% vs 56%). (3) A Comparison of two commercially available anti-HEV IgG kits and re-evaluation of anti-HEV IgG seroprevalence data in developped countries, Bendall et al 2010.

Seroprevalentie

Seroprevalentie geeft aan welke hoeveelheid van de populatie over antilichamen beschikt tegen dit virus. Uit verschillende data blijkt dat deze getallen ver uit elkaar liggen (0.26% – 31%), met de verschillen in kwaliteit van de testen in het achterhoofd houdend is een reële vraag hoe betrouwbaar deze getallen zijn. Is het getal niet vele malen hoger? Wat zijn de gevolgen van deze getallen?

Discussie

Wat voor gevolgen hebben deze data voor ons? Wanneer de seroprevalentie vele malen hoger is, moet hier dan op gescreend worden bij bloed donaties? Iemand kan drager zijn van het HEV virus, zonder hiervan gevolgen te ondervinden. In hoeveel cases uit het verleden waarbij de oorzaak van ziek worden, (en overlijden,) onbekend is, is dit het gevolg van Hepatitis E?
Wat zijn nu echt alle besmettings bronnen? Bekend is dat varkens en wild grote dragers zijn van het virus. Moet al het vlees gescreend worden op HEV?

Voor meer informatie over de HEV kits, neem contact met ons op; tech@sanbio.nl.