DNA of RNA isoleren en kwantificeren uit FFPE tissue

Het meten van DNA of RNA uit tumoren kan veel inzichten geven, maar hoe doe je dit wanneer het DNA/RNA in formaline gefixeerde tissue (FFPE) zit? De nieuwe technieken maken het mogelijk om dit DNA/RNA te isoleren uit dit FFPE tissue, waardoor je toegang krijg tot informatie van onschatbare waarde. Met de verkregen DNA/RNA kun je vervolgens een PCR, qPCR uitvoeren zodat uiteindelijk duidelijk wordt of de kwaliteit van het verkregen DNA/RNA goed genoeg is om mee te gaan sequencen.

FFPE tissue

Het isoleren van DNA/RNA uit FFPE tissue wordt gedaan met een niet toxische methode die speciaal ontwikkeld is om het DNA te isoleren en zuiveren zonder het gebruik van bijvoorbeeld xyleen. Een complete oplossing van de wax wordt verkregen door een speciaal gemaakte buffer waarna een verwarmingsstap de eiwit-DNA links verwijdert. Het resultaat hiervan is dat de opbrengst van het DNA/RNA groot is en vrij van vervuilingen die invloed kunnen hebben op de gevoeligheid en amplificatie stappen.

Hierna kan de functionaliteit en kwaliteit van het DNA bepaald worden met behulp van de QFI™ Score. Met deze Score wordt bepaald welk gedeelte van het genoom DNA goed genoeg is om te amplificeren en uiteindelijk gebruikt kan worden voor Next Generation Sequencing.

Advertenties

Join the resolution!

Het uitvoeren van de Southern blot is een lange en arbeidsintensieve bepaling waar veel valkuilen in zitten. Met de nieuwe mogelijkheden op het gebied van moleculaire testen is het nu mogelijk om deze methode over te slaan voor het bepalen van afwijkingen in het Fragiele X gen.

Fragiele X gen

Het fragiele-X-syndroom is een erfelijke aandoening welke gepaard gaat met een verstandelijk handicap. Het wordt veroorzaakt in een mutatie in het FMR1 gen. Dit FMR1 gen bevat meer dan 200 CGG repeats (herhalingen). Een mutatie in dit gen veroorzaakt het fragiele-X-syndroom. Deze mutatie zet zich eindeloos voort en wanneer dit meer dan 200 herhaling heeft kan het gen niet meer normaal functioneren.

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Detectie

Sinds ’91 wordt het de status van het gen bepaald met behulp van de Southern Blot. Maar zoals eerder beschreven is dit een arbeidsintensieve behandeling, die ook een grote hoeveelheden DNA nodig heeft, slechte gevoeligheid en resolutie heeft vergeleken met de nieuwe PCR methode. Methodes om de gemethyleerde status van het gen te bepalen zonder Southern Blot zijn gebaseerd op chemische of enzymatische voorbehandelingsmethodes van het DNA voor PCR.

Chemische voorbehandeling vereist Natrium BiSulfite om het gemethyleerde Cytosine om te zetten naar Uracil. Deze omzetting kan gemeten worden verschillende technieken inclusief DNA sequencing, PCR en melting curve analyse. Deze methodes zijn meer bruikbaar voor het diagnosticeren van mannelijk DNA omdat de aanwezigheid van 2 X-chromosomen in vrouwelijk DNA de bepaling kan verstoren.

Enzymatische voorbehandeling

De enzymatische voorbehandeling maakt gebruik van methyl gevoelige restrictie enzymen die het ongemethyleerde DNA verteren. Meerdere technieken kunnen hierna gebruikt worden om de gemethyleerde status van het gen te bepalen door het vergelijken van de amplicons van verteerde en onverteerde DNA. Voorbeelden hiervan zijn PCR, het werken met probes of capillaire electroforese.

Recente methodes hebben laten zien dat de enzymatische voorbehandeling in combinatie met complete amplificatie van het FMR1 CGG herhalingen een nauwkeurig beeld geven van zowel mannelijk als vrouwelijk DNA.

bron: www.nomoresouthernblots.com

Het Ph chromosoom, het genetisch defect bij chronische myeloide leukemie (CML)

Chronisch myeloide leukemie (CML) is een vorm van leukemie waarbij witte bloedcellen in overmaat worden geproduceerd. Bij de grote meerderheid wordt het Philadelphia chromosoom gevonden. Het Ph chromosoom is verantwoordelijk voor de codering van BCR-ABL1.

Na de ontdekking van CML, meer dan 150 jaar geleden is er weinig tot geen progressie gemaakt met betrekking tot de genezing. Bestraling zorgde alleen voor een betere levenskwaliteit. De genezingskansen werden groter met de behandeling met Hydroxyurea (HU), en daarna nog groter met allogene hematopoietische stamcel transplantatie.

Het begrijpen van de ziekte begon met de ontdekking van het Philadelphia (Ph) chromosoom. De aanwezigheid van de Ph chromosoom is het gevolg van een genetische translocatie van de chromosomen 9 en 22. De ontdekking van het Ph chromosoom betekende ook de ontdekking van de BCR/ABL1 eiwitten, wat heeft geleid tot nieuwe onderzoeken. Door componenten te ontwikkelen die de activiteit van de tyrokinase verminderen, en dus de ontwikkeling van de ziekte remmen, is er een grote stap gezet in de ontwikkeling van een medicijn.

Detectie methode
Recent is er een nieuwe methode op de markt gekomen om dit Ph chromosoom te detecteren. Bij deze methode wordt een qPCR gecombineerd met een ELISA waarbij gebruik gemaakt wordt van beads. Dit biedt mogelijkheid om meerdere samples tegelijkertijd te testen met een hoge gevoeligheid, de detectie limiet ligt op 1 leukemie cel per 100.000 normale cellen . Door het monitoren van de tyrosine kinase inhibitor (TKI) ontstaat er een goede indicatie over de progressie van de ziekte.