DNA of RNA isoleren en kwantificeren uit FFPE tissue

Het meten van DNA of RNA uit tumoren kan veel inzichten geven, maar hoe doe je dit wanneer het DNA/RNA in formaline gefixeerde tissue (FFPE) zit? De nieuwe technieken maken het mogelijk om dit DNA/RNA te isoleren uit dit FFPE tissue, waardoor je toegang krijg tot informatie van onschatbare waarde. Met de verkregen DNA/RNA kun je vervolgens een PCR, qPCR uitvoeren zodat uiteindelijk duidelijk wordt of de kwaliteit van het verkregen DNA/RNA goed genoeg is om mee te gaan sequencen.

FFPE tissue

Het isoleren van DNA/RNA uit FFPE tissue wordt gedaan met een niet toxische methode die speciaal ontwikkeld is om het DNA te isoleren en zuiveren zonder het gebruik van bijvoorbeeld xyleen. Een complete oplossing van de wax wordt verkregen door een speciaal gemaakte buffer waarna een verwarmingsstap de eiwit-DNA links verwijdert. Het resultaat hiervan is dat de opbrengst van het DNA/RNA groot is en vrij van vervuilingen die invloed kunnen hebben op de gevoeligheid en amplificatie stappen.

Hierna kan de functionaliteit en kwaliteit van het DNA bepaald worden met behulp van de QFI™ Score. Met deze Score wordt bepaald welk gedeelte van het genoom DNA goed genoeg is om te amplificeren en uiteindelijk gebruikt kan worden voor Next Generation Sequencing.

Advertenties

Join the resolution!

Het uitvoeren van de Southern blot is een lange en arbeidsintensieve bepaling waar veel valkuilen in zitten. Met de nieuwe mogelijkheden op het gebied van moleculaire testen is het nu mogelijk om deze methode over te slaan voor het bepalen van afwijkingen in het Fragiele X gen.

Fragiele X gen

Het fragiele-X-syndroom is een erfelijke aandoening welke gepaard gaat met een verstandelijk handicap. Het wordt veroorzaakt in een mutatie in het FMR1 gen. Dit FMR1 gen bevat meer dan 200 CGG repeats (herhalingen). Een mutatie in dit gen veroorzaakt het fragiele-X-syndroom. Deze mutatie zet zich eindeloos voort en wanneer dit meer dan 200 herhaling heeft kan het gen niet meer normaal functioneren.

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Detectie

Sinds ’91 wordt het de status van het gen bepaald met behulp van de Southern Blot. Maar zoals eerder beschreven is dit een arbeidsintensieve behandeling, die ook een grote hoeveelheden DNA nodig heeft, slechte gevoeligheid en resolutie heeft vergeleken met de nieuwe PCR methode. Methodes om de gemethyleerde status van het gen te bepalen zonder Southern Blot zijn gebaseerd op chemische of enzymatische voorbehandelingsmethodes van het DNA voor PCR.

Chemische voorbehandeling vereist Natrium BiSulfite om het gemethyleerde Cytosine om te zetten naar Uracil. Deze omzetting kan gemeten worden verschillende technieken inclusief DNA sequencing, PCR en melting curve analyse. Deze methodes zijn meer bruikbaar voor het diagnosticeren van mannelijk DNA omdat de aanwezigheid van 2 X-chromosomen in vrouwelijk DNA de bepaling kan verstoren.

Enzymatische voorbehandeling

De enzymatische voorbehandeling maakt gebruik van methyl gevoelige restrictie enzymen die het ongemethyleerde DNA verteren. Meerdere technieken kunnen hierna gebruikt worden om de gemethyleerde status van het gen te bepalen door het vergelijken van de amplicons van verteerde en onverteerde DNA. Voorbeelden hiervan zijn PCR, het werken met probes of capillaire electroforese.

Recente methodes hebben laten zien dat de enzymatische voorbehandeling in combinatie met complete amplificatie van het FMR1 CGG herhalingen een nauwkeurig beeld geven van zowel mannelijk als vrouwelijk DNA.

bron: www.nomoresouthernblots.com

Wat is Next Generation Sequencing?

Tijdens DNA sequencen wordt de volgorde bepaald van de nucleotides – adenine, guanine, cytosine en thymine –  van het DNA. De kennis en volgorde van het DNA is van onschatbare waarde voor biologische research, maar ook andere branches die gebruik maken van de DNA sequence zoals de diagnostiek, biotechnologie en forensisch onderzoek. De voordelen van DNA sequencing hebben de ontwikkelingen in de biotechnologie in een stroom versnelling geplaatst. De snelheid van sequencing die bereikt wordt met de moderne technieken zijn onder andere belangrijk geweest in het in kaart brengen van het humaan DNA tijdens het “Human Genome Project”.

Maar hoe werkt het DNA sequencing nu eigenlijk?

Het sequencen van DNA wordt al langere tijd gedaan. In de eerste methode, de Sanger methode, werd een PCR reactie gedaan, met in deze reactie een grote hoeveelheid ddNTPs. Tijdens deze PCR werd ieder base paar met een andere kleur geconjugeerd. Hierna werd de kleur en de lengte van de DNA fragementen bepaald, hiermee werd de sequence bepaald; een stuk DNA met een lengte 35 baseparen eindigend met een blauwe ddNTP wat aangaf dat er op de 35ste positie een C zat.
Het probleem met deze methode was dat het er veel ruimte nodig was. een plek om de PCR uit te voeren en dan cappilaire geltubes of een gewone gel om de lengte van het DNA te bepalen. Gevolg, er kunnen hooguit een paar honderd reacties tegelijkertijd gedaan worden. Er zijn 3 billioen baseparen in het humaan DNA, kortom het kost veel tijd mankracht om op deze manier het humaan DNA in kaarte brengen.

Met de komst van NGS heeft deze problemen overwonnen. Door het gebruik van een van de verschillende platformen kan er nu redelijk snel DNA in kaart gebracht worden. Bij de verschillende platformen plaats je het stuk DNA wat bekeken wordt in een well, dit wordt een cluster genoemd. Daar wordt het sequencen gedaan met als gevolg dat er veel verschillende clusters tegelijkertijd gesequenced kunnen worden. Hierdoor wordt de tijd om een gedeelte van het DNA in kaart te brengen verminderd.

NGS heeft de toekomst, en blijft zich ontwikkelen. Blijf op de hoogte van de laatste ontwikkelingen van NGS, neem contact met ons op en schrijf je in voor onze nieuwsbrief of vraag om een persoonlijke update.

Hoe werkt NGS?

Genoom DNA fragmenten kunnen worden omgezet naar een DNA library die klaar zijn voor het sequencen in de volgende stappen.  Van het gefragmenteerde DNA wordt eerst door middel van een zogenaamd “end repair” de uiteindes blunt end gemaakt (zie onderstaande afbeelding). Vervolgens wordt er een adenine base gekoppeld aan het DNA om zo een A-overhang te creëren. Nu kunnen de barcodes geligeerd worden omdat deze een T-overhang als uiteinde hebben. Na opzuiveren van het DNA worden de geselecteerde fragmenten met behulp van PCR geamplificeerd. Het DNA is nu klaar om te sequencen.

Barcodes

Barcodes bevatten geïndexeerde sequenties. Door verschillende barcodes te gebruiken kunnen er meerdere, verschillende gefragmenteerde stukjes DNA tegelijkertijd gesequenced worden. Met de huidige mogelijkheden van 96 barcodes worden er een veelvoud aan  libraries gemaakt. Het gebruik van de barcodes heeft als gevolg dat er meerdere samples tegelijkertijd  in één laan te sequencen zijn. Hierdoor is het uitvoeren van grotere sequentie projecten sneller, goedkoper en efficiënter geworden.

Bron: Basics: Sequencing DNA

Wat is het belang van de Inhibitor Removal Technology® (IRT) bij DNA isolaties?

Het gepatenteerde IRT® van MoBio geeft researchers de mogelijkheid om DNA te zuiveren uit elk sample, zelfs degene met een hoge concentratie PCR remmers zoals zuren, suikers en kleurstoffen.

Door gebruik te maken van deze gepatenteerde technologie kunnen de enzymatische PCR remmers geisoleerd worden uit alle samples, inclusief water, ontlasting, grond en planten om hoog gezuiverd DNA of RNA te verkrijgen. Dit kan snel en simpel gedaan worden met spin- of capture kollommen. Zelfs gearchiveerde, en op dat moment onbruikbare DNA samples kunnen gezuiverd worden.

Is er data beschikbaar over ge-extraheerde DNA samples met de IRT®?

Het antwoord hierop is JA! Tijdens de ontwikkeling van deze technologie is er een test gedaan met 2 water extractie kits van de leverancier, de PowerWater® en de RapidWater®. De PowerWater® bevat de IRT® technologie, verder zijn de kits identiek.
Vergelijkbare hoeveelheden DNA zijn ge-extraheerd (zie afbeelding), maar de Rt-PCR laat zien dat de IRT® technologie voor zuiverder DNA zorgt.

De IRT technologie wordt gebruikt in de verschillende producten van MoBio, zoals:
Powersoil®, PowerMax®, PowerPlant® en vele andere.

Samples zijn gratis te verkrijgen, vraag uw sample aan via tech@sanbio.nl.

Verdwijnt het PCR-en uit de laboratoriumwereld?

De polymerase-kettingreactie (PCR) is ontwikkeld in 1983. Deze moleculair-biologische laboratoriumtechniek waarmee een specifiek stuk nucleïnezuur (DNA of RNA) wordt geamplificeerd, lijkt niet meer weg te denken uit de huidige laboratoria. Sequencing is de veelgebruikte vervolgstap na PCR. Hiermee kan de volgorde van de nucleïne basen worden bepaald.
Er is een nieuwe Next Generation Sequencing techniek die toe staat dat de uitvoering van de PCR niet nodig is tijdens DNA sequencing. In de figuur wordt de PCR vrije Next Generation Sequencing methode schematisch beschreven.


Zou dit het eind kunnen betekenen van het PCR-tijdperk?