De WeLLevator™, de tool voor gemakkelijk pipetteren in een 96 wells plaat

Veel testen op het lab worden tegenwoordig gedaan in 96-wells platen, waarbij veel gebruik gemaakt wordt van een zogenaamde multichannel pipet. Met deze pipet kunnen 8- of 12-welletjes gevuld worden. Gebruik van deze pipet is vaak lastig omdat er meerdere wells tegelijkertijd gepipetteerd worden.

Wellevator

Vaak is het een uitdaging om de pipetpunten juist uit te lijnen in en 96 wells plaat waardoor bijvoorbeeld de cellen of de pellet geraakt wordt. Dit kan klachten aan de pols als gevolg hebben. Met de komst van de WeLLevator™ kunt u dit probleem tackelen.

Wellevator-1Door de WeLLevator te gebruiken kunnen deze problemen verholpen worden. De pipet kan rusten op de WeLLevator, met als gevolg dat u nergens de pellet of de cellen raakt en geen last van uw pols. In combinatie met een magneet kan de WeLLevator gebruikt worden voor testen met magentische beads.

Voordelen

Gebruik van de WeLLevator heeft als grote voordeel dat er consistente resultaten worden behaald, en zekerheid dat alle wells hetzelfde behandeld worden. Ook de verminderde kans op problemen met de gewrichten, en de mogelijkheid om met magnetische beads te werken zijn grote voordelen.

Advertenties

Op zoek naar een microtiter plaat, maar wat is nu de beste?

De 96-wells plaat is misschien wel de meest gebruikte plaat die gebruikt wordt in de laboratoria. De plaat is verkrijgbaar in losse strips, afbreekbare strips, platte en ronde bodems. Tevens heeft de coating van de de plaat ook invloed op de resultaten van de assay. Welke plaat er ook gekozen wordt, er zijn verschillende keuzes die nu gemaakt moeten worden om de juiste coating te kiezen om het target te binden.

Plaat coating

Om het target te binden is het van belang om de juiste coating op de plaat te gebruiken. Een passieve coating heeft een brede range aan mogelijkheden omdat deze verschillende biomoleculen kan binden, gebaseerd op verschillende zwakke molecuul interacties. Deze verschillende interacties vormen samen een sterke binding aan het biomolecuul. Passieve coating is daarom primair bruikbaar voor middelgrote tot grote biomoleculen, zoals antilichamen. De exacte hoeveel moleculaire bindingsplaatsen is afhankelijk van het te binden biomolecuul, en de interactie met de coating. Bij een grote verscheidenheid aan biomoleculen wordt gebruik gemaakt van de passieve binding om het biomolecuul stabiel te binden.

De passieve coating is onder te verdelen in 4 verschillende subgroepen op basis van hydrofibiciteit; Hydrofoob, licht hydrofofiel, hydrifiel en sterk hydrofiel.

Hydrofoob
De hydrofobe coating wordt gebruikt voor de binden van biomoleculen rijk aan lipides.

Weinig hydrofiel
De licht hydrofiele coating vergroot de range aan biomoleculen die gebonden kunnen worden, inclusief glyco-eiwitten en lipopolysaccharides in serum, of serum samples. Met deze coating wordt de a-specifieke binding geminimaliseerd om de signal-to-noise (S/N) ratio te verhogen en hierdoor de gevoeligheid te vergroten.

Hydrofiel
De hydrofiele coating is geoptimaliseerd om grote hoeveelheden IgG te binden, wat deze platen uiterst geschikt maakt voor het gebruik in antilichaam sandwich assay’s, bijvoorbeeld ELISA. Verder heeft deze coating de mogelijkheid om een grote variëteit aan biomoleculen te binden die hydrofiele/hydrofobe karakteristieken hebben.

Sterk hydrofiel
Deze coating bindt in water oplosbare eiwitten en glycanen, maar de binding is pH gevoelig.

Overzicht bindingscapaciteit Nunc platen (Bron; ThermoFisher).

           

 

 

 

 

 

Welke plaat is het beste geschikt voor uw experiment? Komt u er niet uit? Vraag een sample aan via tech@sanbio.nl.

MBL, een deel van het afweersysteem

Het mensenlijk lichaam wordt dagelijks aangevallen door 10-duizenden lichaamsvreemde moleculen, deze worden door ons immuunsysteem verwijderd zonder dat we er iets van merken. Ons immuunsysteem is opgebouwd uit een groot aantal cellen en moleculen. Deze werken door interactie in lymfoïde organen samen aan het afweren van lichaamsvreemde moleculen. Het immuunsysteem is opgebouwd uit een aangeboren, niet specifiek systeem, en een aangeleerd, specifiek systeem. Het aangeboren systeem is de “first line of defence”. Het aangeleerde systeem heeft geheugen cellen, deze cellen herkennen een lichaamsvreemd molecuul en kunnen meteen de juiste antilichamen laten produceren om het molecuul te verwijderen.

Het aangeboren systeem bestaat uit verschillende cellen in ons bloed, zoals granulocyten, monocyten, macrofagen, dendritische cellen en Natural-Killer cellen (NKcellen). Deze hebben ieder zijn eigen taak in het niet-specifieke systeem.
Naast deze cellulaire factoren zijn er ook humorale factoren die een invloed hebben op dit systeem. Deze factoren worden het complement systeem genoemd.

Afb 1: Complement system, provided by Hycult Biotech, Uden

 In dit complement systeem zijn 3 verschillende routes, de klassieke route, de alternatieve route en de Manose Binding Lectin (MBL) route. Al deze verschillende routes activeren het complement systeem wat als doel heeft het lichaamsvreemde molecuul  te fagocyteren.

Naast het aangeboren, niet specifieke systeem is het immuunsysteem ook opgebouwd uit het aangeleerde, specifieke systeem. In dit systeem zijn T-cellen de belangrijkste cellen, deze zorgen voor de cellulaire immuniteit. De B-cellen zorgen voor de humorale immuniteit. Dit systeem is in het bezit van memory cellen, die bij herkenning van het lichaamsvreemde molecuul meteen het juiste antilichaam kunnen laten produceren. Hierdoor wordt het lichaamsvreemde molecuul snel verwijderd. Doordat er veel verschillende lichaamsvreemde moleculen ons lichaam aanvallen zijn er ook veel verschillende memory cellen.

Figure 2: Membrane Attack Complex (MAC)

In het klassieke systeem bindt het C1-complex aan de lichaamsvreemde stof (zie afbeelding 1). Na activatie van het complement systeem volgt er een cascade met moleculen die binden aan het lichaamsvreemde molecuul met als uiteindelijk resultaat de vorming van het MAC (Membrane Attack Complex, Afb 2). Hierdoor ontstaan er gaten in het celmembraan en wordt de lichaamsvreemde cel gefagocyteerd.Het complement systeem wordt geactiveerd zodra er een lichaamsvreemde stof is gedetecteerd. Het complement systeem omvat verschillende plasma’s en membraaneiwitten die een taak hebben bij de verdediging tegen deze lichaamsvreemde stof.

MBL is een serum eiwit die het complement systeem kan activeren. In verschillende artikelen is bewezen dat de MBL route een grote regulator is van het complement systeem. Doordat MBL bindt aan de lichaamsvreemde stof met behulp van mannose wordt de MBL route geactiveerd en de lichaamsvreemde cel uiteindelijke gefagocyteerd. MBL lijkt op C1q, het eiwit dat aan de start staat van de klassieke route. 

Belangrijke factoren die het belang van onderzoek naar MBL stimuleren zijn:

  • Het is de meest voorkomende immuundeficiency
  • Het is een risicofactor in combinatie met autoimmuun afwijking
  • Heeft een verband met verhoogd risico of scepsis.

Veel pasgeborene of te vroeg geborene hebben veel kans op infecties. Uit verschillende artikelen blijkt dat een afwijking in de MBL route hier een grote oorzaak in speelt. Uit onderzoek blijkt dat 40% van de onderzochte pasgeborene een te laag MBL gehalte had.(Low mannose-binding lectin (MBL) levels in neonates with pneumonia and sepsis, Frakking et all, 2007). Lage concentraties MBL vlak na de geboorte wordt geassocieerd met een verhoogde kans op de ontwikkeling van pneumonia en bevestigde bloedvergiftiging door een bacterie door een verlaagde capaciteit van fagocytose of opsonisatie van het lichaamsvreemde molecuul.

Is het zinvol om alle pasgeborene te testen op afwijking in de MBL route? Of is het alleen van toepassing op prematuur geborene?

Hepatitis E, onderschatte ziekte nr 1?

Hepatitis E (HEV) wordt gezien als backpakkers disease, maar klopt dit wel? HEV wordt steeds vaker als diagnose gesteld bij mensen die helemaal niet reizen of in landen geweest zijn waar deze ziekte heerst. Wat zijn de gevolgen hiervan? Hoe wordt het virus verspreid?
Dat HEV geen onschuldig virus is blijkt uit de literatuur. De combinatie van HEV en chronische leveronsteking heeft een slechte prognose. Er wordt vaak de verkeerde diagnose gesteld; Drug-induced liver injury. (1); Hepatitis E; an emerging infection in developed countries. Klinisch is HEV niet te onderscheiden van Hepatitis A, maar Hepatitis A komt minder voor.

Inleiding

HEV is een acute leverontsteking op basis van een besmetting met het Hepatitis E-virus. HEV is een RNA virus onderverdeeld in 4 verschillende genotypes. Genotypes 1 & 2 zijn alleen vastgesteld in mensen, genotypes 3 & 4 zijn naast mensen ook vastgesteld in verschillende zoogdieren zoals varkens, kippen, herten. Genotype 3 wordt vaak als diagnose gesteld bij mensen in de westerse wereld. HEV is een ziekte die zich alleen in mensen uit, maar mede wordt overgedragen door dieren. Het varken is hierbij de grootste bron. Meer dan 50% van de in 2005 onderzochte Nederlandse varkensboerderijen zijn besmet (Hepatitis E virus risk profile, Rutjes et al; 2005), waarbij het HEV is gemeten in de faeces van de dieren.
HEV is vaak voorkomend in de gehele tropische en subtropische zone, waarbij India en Noord-Afrika bekend staan als haarden van HEV. Genotype 2 wordt hier vaak bevestigd (2) (Hepatitis E in Nederland, Zaaijer 2007) HEV kan asymptotisch voorkomen, waardoor de mens wel dragend kan zijn, maar niet ziek.
Er wordt verondersteld dat de ziekte op verschillende manieren kan worden overgedragen maar er zijn er nog niet zoveel bevestigd.  De bevestigde routes van infectie zijn bloedtransfusie, het eten van niet goed gekookt vlees van varkens en wild.
De faeces van varkens en wild komen uiteindelijk in het water terecht. Zou de infectie ook kunnen worden opgelopen door het drinken van kraanwater, het eten van groentes die besproeid zijn of door recreatie in zeeën of rivieren?
De incubatie periode voor HEV is van 2 tot 9 weken, en heeft verschillende symptomen zoals geelzucht, koorts, braken en gewichtsverlies.

Is het wel zo’n groot probleem?

In het onderzoek naar HEV is nog veel onbekend? HEV is sporadisch vast gesteld in de westerse landen, maar is dit het gevolg van het ontbreken van een goede detectie methode? Of weet men niet waar, of hoe, er gezocht moet worden? HEV wordt over de hele wereld gedetecteerd, met de gevalideerde methodes of met home-made testen. Welke resultaten zijn betrouwbaar?
Uit vergelijk tussen de verschillende commercieel verkrijgbare testen komen grote verschillen voor in gevoeligheid, en betrouwbaarheid van de resultaten. In de vergelijkings studie tussen de anti-HEV kits van Wantai en Genelab blijkt de kit van Wantai gevoeliger te zijn (0.25 vs 2.5 WHO units/mL) en meer sera als positief te bestempelen van HEV bevestigde casussen (98% vs 56%). (3) A Comparison of two commercially available anti-HEV IgG kits and re-evaluation of anti-HEV IgG seroprevalence data in developped countries, Bendall et al 2010.

Seroprevalentie

Seroprevalentie geeft aan welke hoeveelheid van de populatie over antilichamen beschikt tegen dit virus. Uit verschillende data blijkt dat deze getallen ver uit elkaar liggen (0.26% – 31%), met de verschillen in kwaliteit van de testen in het achterhoofd houdend is een reële vraag hoe betrouwbaar deze getallen zijn. Is het getal niet vele malen hoger? Wat zijn de gevolgen van deze getallen?

Discussie

Wat voor gevolgen hebben deze data voor ons? Wanneer de seroprevalentie vele malen hoger is, moet hier dan op gescreend worden bij bloed donaties? Iemand kan drager zijn van het HEV virus, zonder hiervan gevolgen te ondervinden. In hoeveel cases uit het verleden waarbij de oorzaak van ziek worden, (en overlijden,) onbekend is, is dit het gevolg van Hepatitis E?
Wat zijn nu echt alle besmettings bronnen? Bekend is dat varkens en wild grote dragers zijn van het virus. Moet al het vlees gescreend worden op HEV?

Voor meer informatie over de HEV kits, neem contact met ons op; tech@sanbio.nl.

ELISA, zelf ontwikkelen of een kant-en-klare kit?

De ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) is gebaseerd op een immunochemische reactie. Alle immunochemische bepalingen hebben hetzelfde principe: de specifieke binding tussen antigeen en antistof. Door het aantonen van dit complex in bloed, serum of andere lichaamsvloeistof van mens of dier is het mogelijk bij te dragen aan de diagnose van een infectieziekte of een autoimmuunziektePrincipe van de ELISA.

Zelf een ELISA ontwikkelen is een optie, maar voor steeds meer bepalingen is er een commerciele kit verkrijgbaar. Wat zijn de voor- en nadelen van zelf een ELISA ontwikkelen? Hoeveel tijd neemt het in beslag? Aan welke eisen moet een ELISA voldoen? Is het van belang de “low affinity” antibodies te meten? Is het nog wel interessant om zelf een ELISA te ontwikkelen?