Transfectie, welke mogelijkheden zijn er?

Transfectie is het proces van het overbrengen van één bepaalde nucleine sequentie in een eukaryote cel. Nucleine sequenties die vaak gebruikt worden zijn DNA, RNA en eiwitten. Welke methodes zijn verkrijgbaar voor de transfectie? Hier worden er een aantal beschreven.

Magnetofectie
Magnetofectie is één van de mogelijkheden. Deze methode bindt nucleïnezuren of andere vectoren met magnetische nanodeeltjes, welke bedekt zijn met kationische moleculen. De magnetische nanodeeltjes zijn gemaakt van ijzer oxide, wat volledig biologisch afbreekbaar is, gecoat met specifieke kationische gepatenteerde moleculen. Hun associatie met het gen (DNA, siRNA, ODN, virus, etc.) wordt bereikt door zout-geïnduceerde colloïdaal aggregatie en elektrostatische interactie van de vectoren.

De resulterende moleculaire complexen zijn vervolgens gericht op de cellen, ondersteund door een passende magnetisch veld. Membraan architectuur en structuur blijven intact in tegenstelling tot andere fysieke transfectie methoden die schade geven of electroshock, die een gat maken in de celmembranen. Bovendien zijn de magnetische nanobeads volledig biologisch afbreekbaar en niet giftig bij de aanbevolen doseringen en zelfs nog hoger. Op deze manier wordt de volledige toegepast vector geconcentreerd op de cellen. Dus 100% van de cellen komt in contact met een belangrijke vector dosis.

Lipofectie
Lipofectie is een methode om genetische materiaal in de cel te brengen gebruik makende van liposomen. Het lipofectamine vormt vesikels met de complexen waarvan de buitenzijde qua samenstelling gelijkaardig is met die van het celmembraan. Als gevolg hiervan zullen de vesikels samensmelten met het celmembraan en zijn inhoud in de cel loodsen.
 
Elektroporatie
Elektroporatie is een techniek die door het aanleggen van een extern elektrische veld een verhoging van de elektrische geleiding en de permeabiliteit van het celmembraan als gevolg heeft. Het is een methode om extracellulaire partikels in de cel te brengen. De elektroporatiecondities moeten zodanig gekozen worden dat na introductie van de extracellulaire partikels het celmembraan zich spontaan herstelt en dat de schade aan de cellen zoveel mogelijk beperkt blijft.
 
i-MICST
De i-MICST (Intergrated Magnetic Immuno-Cell Sorting and Transfection/Transduction) technologie biedt de mogelijkheid om cellen te isoleren en modificeren in één efficiënte en betrouwbaar systeem.
Advertenties

Beschikbare methodes voor eiwitexpressie

Eiwitten spelen een belangrijke rol in veel verschillende biologische processen. Om een eiwit te bestuderen is er vaak een grote hoeveelheid van het eiwit nodig. Wat zijn de mogelijkheden om een grote hoeveelheid eiwit te verkrijgen? Is er verschil in opbrengst en kwaliteit van het eiwit na het tot expressie brengen door een methode? En in hoeverre zijn post-translationele modificaties belangrijk voor de oplosbaarheid van het eiwit? Hier wordt beschreven wat de mogelijkheden zijn en hun voor- en nadelen.

Eiwitexpressie in bacteriën
Eiwitexpressie in bacteriën is de meest bekende, gemakkelijkste en meest gebruikte vorm van eiwitexpressie. Eiwitexpressie in een microbiële eukaryotische gastheer biedt de mogelijkheid om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren op een snelle en eenvoudige manier.

Een eencellig micro-organisme is gemakkelijk te manipuleren, te kloneren en groeit snel op goedkope media bij hoge celdichtheden. Door de mogelijkheid om eenvoudige post-translationele modificaties uit te voeren aan het verkregen recombinante eiwit is het kweken van eiwitten in eukaryotische cellen een veel gebruikte techniek. Ook zijn er tegenwoordig speciaal ontwikkelde bacteriestammen te verkrijgen die gespecialiseerd zijn in het uitvoeren van een bepaalde modificatie.

Toch zijn vaak deze post-translationele modificaties uitgevoerd door bacteriën niet voldoende bij het tot expressie brengen van grote eiwitten (> 70 kDa), zeer gecompliceerde eiwitten en moeilijk oplosbare eiwitten. Dan kan worden uitgeweken naar een andere methode.

Andere mogelijkheden
Behalve het kweken in bacteriën zijn er natuurlijk nog andere methodes zoals het kweken in gist, insectcellen en zoogdiercellen. Iedere mogelijkheid heeft zijn voordelen en nadelen, maar welke zijn dat dan? Het tot expressie brengen van eiwit in bacteriën en gist heeft als grote voordeel dat het snel is en grote hoeveelheden oplevert, met als groot nadeel de kwaliteit. Dit in tegenstelling tot het in expressie brengen in insectencellen of zoogdiercellen. Hier is de hogere kwaliteit een voordeel. 

 
Welk expressie systeem er het beste gebruikt kan worden hangt af van de eisen die gesteld zijn aan het eiwit, het soort eiwit, de grootte en de uiteindelijke toepassing waar het eiwit voor gebruikt gaat worden. Wordt er gekozen voor een hoge opbrengst en is het eiwit niet te groot en goed oplosbaar, dan zal expressie in bacteriën of gist de meest optimale en snelste methode zijn.

Zodra het gaat om een groter eiwit dat moeilijker oplosbaar is en dus vraagt om goede post-translationele modificaties, kan beter gekozen worden voor expressie in insectencellen of zoogdiercellen.