Prosthetic Joint Infections (PJI), nu serologisch te bepalen

Het vervangen van een gewricht is een hele operatie, vaak bedoeld om de mobiliteit te vergroten. Maar wat als er na de operatie een infectie ontstaat? Infecties die geassocieerd worden met een gewrichtsoperatie komen niet zo vaak voor, maar zorgen voor de meest verwoestende complicaties. Naast langdurige ziekenhuisopname, risico op complicaties als gevolg van extra chirurgische behandelingen en de mogelijkheid van een hernieuwde handicap.

BJI InoplexMet de komst van de nieuwe BJI Inoplex test kunnen infecties eerder worden opgepikt. Het is bedoeld als hulpmiddel bij de detectie van orthopedische infecties, naast de reeds bestaande methoden (zoals CRP of radiografie) die geen operatieve handeling vereisen. De test is een non-invasieve test op basis van de immuunrespons van patiënten, die verdacht worden orthopedische infecties te hebben en met pijnklachten terugkomen in de kliniek. Deze patiënten zijn veelal kandidaat voor revisie chirurgie. Een goede diagnose voorafgaande aan de operatie kan van groot belang zijn om een goed behandelingstraject te bepalen.

De BJI Inoplex test is een multiplex assay die bestaat uit een panel van 16 antigenen die zijn geïsoleerd uit de meest voorkomende pathogenen die orthopedische infecties kunnen veroorzaken. De antigenen zijn gekoppeld aan microscopische beads op basis van de Luminex Technologie, die reageren met IgG antistoffen in het serum van de patiënt.

Herprogrammering van stamcellen

Wetenschappers zijn al jaren bezig met het combineren van volgroeide cellen met embryonale cellen, maar beginnen nu pas te begrijpen welke mechanismes hieraan deelnemen. Wie kent er niet het schaap Dolly?

Schaap Dolly

In 1996 werd schaap Dolly gegroeid uit een uiercel van een volwassen ooi, een vrouwtjesschaap. Hiervoor werden de gespecialiseerde uiercellen “aangezet” tot een nieuwe taak, het uitgroeien van een nieuw organisme. Dat was de belangrijkste ingreep in het genetisch materiaal van het aankomend schaap. Daarna werd het gekloond en de tot geslachtscel omgebouwde cel in een draagmoederschaap geplaatst. Dolly was het enige geslaagde experiment uit meer dan 300 pogingen.

Induced pluripotent stem cells (iPS)

Het her programmeren van cellen kreeg steeds meer aandacht en schoot omhoog nadat er in 2006 werd ontdekt dat gespecialiseerde volwassen muiscellen konden worden aangezet tot nieuwe taken door slechts 4 genen. Hiermee werden de zogenaamde “induced pluripotent stem (iPS) cells” ontdekt. De methode was simpel genoeg zodat bijna ieder lab dit kon doen. Hiermee groeide ook de hoop dat het mogelijk kon zijn dat pluripotente cellen beschadigde of kapotte cellen kon herstellen of vervangen. Uiteindelijk na vele jaren onderzoek blijkt het gebruik van pluripotente cellen succesvol te kunnen worden toegepast, nadat in 2014 retinale cellen gekweekt uit pluripotente stamcellen, gebruikt werden in een transplantatie in het oog van een vrouw met een oogziekte. Dit was de eerste keer in de geschiedenis dat geherprogrammeerde stamcellen hiervoor werden gebruikt.(bron).

Aan dit alles zit één nadeel, niemand weet op dit moment exact hoe het “ombouwen” van volgroeide cellen naar pluripotente cellen werkt. Één van de problemen is dat het proces voor het maken van de pluripotente cellen niet effectief en variabel is. Alleen een kleine fractie van de cellen wordt omgezet naar pluripotente cellen en zelfs deze kunnen verschillen op minieme, maar belangrijke vlakken. Om het geheim van het omzetten naar pluripotente cellen te ontrafelen is er een internationale werkgroep opgericht met hierin de meest vooraanstaande wetenschappers op het gebied van stamcel technologie, genaamd Project Grandiose.

Onstaan van F-cellen, bron stemformatics.org

Project Grandiose

De grootste ontdekking van dit project is de ontdekking van een nieuwe categorie pluripotente cellen, de F-klasse cellen. Deze cellen verschillen van de iPS cellen op een van de strengste testen van pluripotentie; wanneer ingebracht in Muis embryo’s helpen ze niet met het maken van nieuw weefsel.

Het her programmeren van volgroeide cellen naar iPS cellen heeft nog vele geheimen en onderzoek om haar geheimen te ontrafelen is in volle gang. Één ding is zeker:

The one thing that we know is that it’s not magic,

there is a mechanism

 

bron: The Blackbox of reprogramming, David Cyranoski

DNA of RNA isoleren en kwantificeren uit FFPE tissue

Het meten van DNA of RNA uit tumoren kan veel inzichten geven, maar hoe doe je dit wanneer het DNA/RNA in formaline gefixeerde tissue (FFPE) zit? De nieuwe technieken maken het mogelijk om dit DNA/RNA te isoleren uit dit FFPE tissue, waardoor je toegang krijg tot informatie van onschatbare waarde. Met de verkregen DNA/RNA kun je vervolgens een PCR, qPCR uitvoeren zodat uiteindelijk duidelijk wordt of de kwaliteit van het verkregen DNA/RNA goed genoeg is om mee te gaan sequencen.

FFPE tissue

Het isoleren van DNA/RNA uit FFPE tissue wordt gedaan met een niet toxische methode die speciaal ontwikkeld is om het DNA te isoleren en zuiveren zonder het gebruik van bijvoorbeeld xyleen. Een complete oplossing van de wax wordt verkregen door een speciaal gemaakte buffer waarna een verwarmingsstap de eiwit-DNA links verwijdert. Het resultaat hiervan is dat de opbrengst van het DNA/RNA groot is en vrij van vervuilingen die invloed kunnen hebben op de gevoeligheid en amplificatie stappen.

Hierna kan de functionaliteit en kwaliteit van het DNA bepaald worden met behulp van de QFI™ Score. Met deze Score wordt bepaald welk gedeelte van het genoom DNA goed genoeg is om te amplificeren en uiteindelijk gebruikt kan worden voor Next Generation Sequencing.

Groeifactoren voor stimulatie celgroei in research setting

Groeifactoren zijn van nature voorkomende substanties die de mogelijkheid hebben om celgroei stimuleren. De groeifactoren zijn belangrijk voor de regulatie van verschillende cellulaire processen, en fungeren als signaalmoleculen tussen cellen. Ze initiëren cellen om te differentiëren en verouderen. Er zijn veel verschillende groeifactoren bekend die allen een andere invloed hebben op de cellen.

Reproduceerbaarheid

Voor het gebruik van groeifactoren in celassays is reproduceerbaarheid van de resultaten van essentieel belang. Eén van de stoffen die invloed heeft op de reproduceerbaarheid is endotoxine.

Endotoxines (lipopolysaccharides, LPS) worden geproduceerd in bacteriën zoals E. coli, die de meest gebruikte bacterie is voor de productie van groeifactoren.

Verschillende studies hebben nu bewezen dat endotoxine contaminatie, die aanwezig zijn in de groeifactoren geproduceerd in E. coli (1 EU/µg of 0.1 ng/ml), de cellen kunnen beïnvloeden. Dit beïnvloedt de reproduceerbaarheid van de celcultuur, omdat kleine verschillen in de concentratie van deze endotoxines onvoorspelbare effecten hebben op celkweek. Het gebruik van endotoxine-vrije groeifactoren verhoogt de reproduceerbaarheid van celkweek experimenten.

  • Verbeterde reproduceerbaarheid verhoogt consistentie in stamcel experimenten
  • Bespaart tijd en kostbare cellen
  • Leidt tot vereenvoudigde transfer van stamcel kweekprotocol voor pre-klinische research naar klinische trials

Invloed van endotoxine op celkweek experimenten, ORFgenetics 2014

Uitgebreid onderzoek laat duidelijk zien wat de invloed van endotoxines, toegestaan tijdens de productie van groei factoren in E.coli, is op stamcel onderzoek.

Microsatellite Instability (MSI)

Darmkanker is een van de meest voorkomende ziektes in de westerse wereld. Ondanks verbeteringen in operatietechnieken en chemotherapie zijn de vooruitzichten niet significant verbeterd in de laatste jaren.

Ondanks verschillende onderzoeken naar dieetfactoren, is de meest voor de hand liggende oorzaak, erfelijkheid, weinig onderzocht. De kennis over erfelijke factoren van kanker is schaars. Dit terwijl de oorzaak van kanker vaker erfelijk is dan is gedacht.

Heredarity nonpolyposis colorectal carcinoma (HNPCC), ook wel Lynch syndroom, is een dominant autosomaal syndroom wat verantwoordelijk is voor 5-10% van alle darmkanker lasten. Het gebrek aan diagnostische karakteristieken heeft gezorgd voor de introductie van bepaalde criteria om een diagnose te kunnen stellen. Deze criteria, Amsterdam criteria I, werden vastgesteld om HNPCC te diagnosticeren.

Er zijn veel onderzoeken gedaan naar de erfelijke factoren van HNPCC waaruit blijkt

PMS2 in colon cancer

PMS2 in colon cancer

dat microsatellite instability (MSI) in sommige gevallen gelinkt kan worden. Eind ’93 werd het verantwoordelijke gen, MSH2, gekloneerd en de mutaties in Lynch syndroom geïdentificeerd. Een tweede gen werd geïdentificeerd in ’94 welke ook werd gelinkt aan Lynch syndroom, MLH1. In de jaren hierna werden ook PMS2 en MSH6 geïdentificeerd als mutaties met Lynch syndroom als gevolg.

DNA replicatie wordt geassocieerd met een eindige error rate, inclusief de incorporatie van  mismatch van baseparen, en het verkeerd aflezen van DNA strengen tijdens duplicatie. Het niet kunnen repareren van deze mismatch resulteert in mutaties. Het DNA MisMatch Repair (MMR) systeem herkent deze fouten tijdens DNA polymerase. Een link tussen MSI en gebrekkige MMR was herkend.

Resultaten van MMR IHC testen vergeleken met MSI testen komen grotendeels overeen. Tijdens een grote studie werd voor het gecombineerd gebruik van MLH1 en MSH2 in IHC een gevoeligheid van 92.3%, en specificiteit van 100% gemeten voor de identificatie van tumoren. De toevoeging van MSH6 en PMS2 aan het IHC panel zou de gevoeligheid moeten verhogen aangezien MSH6 en PMS2 mutaties steeds meer herkend worden als oorzaak van het Lynch syndroom.

Niet alleen het Lynch syndroom maar ook andere kankersoorten kunnen worden herkend met het zogenaamde MSI panel. Dit panel bevat de PMS2, MSH6, MSH2 en de MLH1. Het gebruik van dit panel zou kunnen meewerken aan het onderzoek naar de invloed van erfelijke factoren.

Transfectie en drug delivery

Tecrea is actief in het veld van de basale research. Ze richten zich op het creatief gebruik van nanotechnologie voor de opname van kleine en grote moleculen in de cel.  Doordat veel medicijnen niet door de celwand kunnen is dit één van de problemen in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Met de research naar het verbeteren van de doorgang van de celwand met het intact houden van de werking van de cel ondersteunt Tecrea onderzoek naar nieuwe moderne medicijnen.

Transfectie

Transfectie is het inbrengen van lichaamsvreemde stoffen in een cel met het behoud van de werking van de cel. Tecrea heeft hiervoor HappyFect™ ontwikkeld. HappyFect™ is een revolutionaire nieuw transfectie reagent die plasmides  en andere kleine lichaamsvreemde stoffen in een cel kan brengen zonder de cel te doden of te inactiveren. HappyFect™ kan gebruikt worden in verschillende zoogdiercellen, is niet toxisch en snel. Met behulp van HappyFect™ kan snel en effectief plasmides en siRNA worden ingebracht in de cel.

Drug delivery

Veel bruikbare medicijnen worden niet op de markt gebracht omdat ze niet of slecht de celwand door kunnen. De opname van het medicijn is de belangrijkste, maar moeilijkste punt in de ontwikkeling van een medicijn. Zelfs bestaande medicijnen zouden nog beter kunnen werken wanneer de opname door de cel beter is. Met NanoCargo™ kunnen grotere eiwitten en moleculen worden opgenomen door de cel.

Nanotechnolgie

Bij onderzoek naar onder andere medicijnen wordt steeds meer naar details gekeken. Waar microtechnologie de toekomst was zijn we nu vooral geinteresseerd in de nog kleinere details van de cel. Met behulp van nanotechnologie kan nog beter in kaart worden gebracht hoe de mechanismes in het lichaam werken.

Join the resolution!

Het uitvoeren van de Southern blot is een lange en arbeidsintensieve bepaling waar veel valkuilen in zitten. Met de nieuwe mogelijkheden op het gebied van moleculaire testen is het nu mogelijk om deze methode over te slaan voor het bepalen van afwijkingen in het Fragiele X gen.

Fragiele X gen

Het fragiele-X-syndroom is een erfelijke aandoening welke gepaard gaat met een verstandelijk handicap. Het wordt veroorzaakt in een mutatie in het FMR1 gen. Dit FMR1 gen bevat meer dan 200 CGG repeats (herhalingen). Een mutatie in dit gen veroorzaakt het fragiele-X-syndroom. Deze mutatie zet zich eindeloos voort en wanneer dit meer dan 200 herhaling heeft kan het gen niet meer normaal functioneren.

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Schematische beschrijving van een Southern Blot analyse

Detectie

Sinds ’91 wordt het de status van het gen bepaald met behulp van de Southern Blot. Maar zoals eerder beschreven is dit een arbeidsintensieve behandeling, die ook een grote hoeveelheden DNA nodig heeft, slechte gevoeligheid en resolutie heeft vergeleken met de nieuwe PCR methode. Methodes om de gemethyleerde status van het gen te bepalen zonder Southern Blot zijn gebaseerd op chemische of enzymatische voorbehandelingsmethodes van het DNA voor PCR.

Chemische voorbehandeling vereist Natrium BiSulfite om het gemethyleerde Cytosine om te zetten naar Uracil. Deze omzetting kan gemeten worden verschillende technieken inclusief DNA sequencing, PCR en melting curve analyse. Deze methodes zijn meer bruikbaar voor het diagnosticeren van mannelijk DNA omdat de aanwezigheid van 2 X-chromosomen in vrouwelijk DNA de bepaling kan verstoren.

Enzymatische voorbehandeling

De enzymatische voorbehandeling maakt gebruik van methyl gevoelige restrictie enzymen die het ongemethyleerde DNA verteren. Meerdere technieken kunnen hierna gebruikt worden om de gemethyleerde status van het gen te bepalen door het vergelijken van de amplicons van verteerde en onverteerde DNA. Voorbeelden hiervan zijn PCR, het werken met probes of capillaire electroforese.

Recente methodes hebben laten zien dat de enzymatische voorbehandeling in combinatie met complete amplificatie van het FMR1 CGG herhalingen een nauwkeurig beeld geven van zowel mannelijk als vrouwelijk DNA.

bron: www.nomoresouthernblots.com